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3其它纯化方法
生化科技學系 酵素純化與分析 3
3 其它純化方法：
大量純化酵素時，通常前面的步驟使用傳統層析方法，再加上HPLC 或FPLC 就可以得到
相當均質的蛋白質。以下的製備式電泳及超高速離心法，也可增加純度，但處理量較少；
而超微薄膜過濾並非純化步驟，但在純化的各階段過程，可濃縮蛋白質並除去小分子。
3.1 製備式電泳：
製備式電泳通常以不含 SDS 的原態disc進行，可回收具有活性的蛋白質；蛋白
質樣本要先經部分純化，否則效果不佳，事先多以分析式電泳確定所要色帶的位置。詳
細說明可參考酵素分析的電泳部分。
a. 電泳用具：
商品的製備式電泳器具很多，都相當複雜且昂貴，但使用一般 8 ×16 cm 大小的垂直平
板電泳，再利用3 mm 厚的間隔條即可進行，量小時用迷你電泳亦足夠使用。
b. 操作方式：
(1) 鑄膠：分離膠体只佔全高度一半，焦集膠体佔四分之一，則樣本可佔其餘的四分之一
(以上述大小的膠体而言約有 15 mL) ，不必用樣本齒模，因此只跑一種樣本。
(2) 預跑：最好在樣本加入前，先預跑約20 min ，以除去APS 的影響。
(3) 電泳：可在冷房進行，條件大略同一般電泳，勿使膠体過熱，也不要跑太快。
(4) 定位蛋白質：方法很多，蛋白質量多時可以300 nm 波長紫外光照射直接觀察，切出
所呈現的色帶；否則要先切一小條膠体染色，再比對位置切出色帶。
(5) 電泳溶離：以電泳收集膠体內的蛋白質，這一步會損失不少蛋白質，要特別小心。
3.2 超高速離心法：
a. 沉降係數：
蛋白質分子在離心時，其分子量、分子密度、組成、形狀等，均會影響其沉降速率，沉
降係數即用來描述此沉降性質，其單位為S (Svedberg unit) ，每一種蛋白質的沉降係數
與其分子密度或分子量成正比。不同沉降係數的蛋白質，可利用超高速離心法，在密度
梯度中進行分離。
b. 密度梯度作法：
一般有三種製作梯度的方式：
(1) 在樣本溶液中直接溶入CsCl ，經離心後可自動形成CsCl 的濃度梯度。
(2) 使用梯度製造器，在離心管內預先拉好甘油或蔗糖的梯度，加樣本後離心。
(3) 若對蛋白質性質與離心條件極為熟悉，以上亦可以 階段式(stepwise) 梯度進行。
c. 兩種離心方式：
上述b (1) 及 (2) 二者，分屬兩類不同的離心形式，列表並以圖解說明如下︰
EPA 2018 51
酵素純化與分析 3 國立臺灣大學
表 3.1 兩種超高速離心比較 Two ultracentrifuge types
Centrifuge Sedimentation
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