08第八讲蛋白质的化学修饰与克隆(一).ppt

第八讲 蛋白质的化学修饰与克隆表达（一） 第一节 蛋白质的化学修饰 第二节 蛋白质的分子生物学改造 第三节 蛋白质的克隆与表达 第一节 蛋白质的化学修饰 4、蛋白修饰意义（为什么？） 物化性质的改善和生物学特性，（酶—加酶洗衣粉、耐有机溶剂） 解析和理解蛋白质结构和功能的关系，（酶活性中心） 创造新的蛋白质分子。（修饰——新蛋白质分子） 5、蛋白修饰的应用——举例说明 探测蛋白质必需基团的性质和数目 用于蛋白质纯度鉴定——N端分析 用于蛋白质一级结构的测定——Edman降解——自动氨基酸测序 利用亲和标记——探测活性部位局部构象变化 利用交联反应，交联受体或激素——亲和层析 改造蛋白质的性质——PEG修饰 蛋白质化学修饰的例子 固定化酶 酶的非水相催化，稳定性提高等 利用化学法和酶法相结合，用猪胰岛素制备人胰岛素 降低免疫原的免疫反应性——抑制Ig产生； 蛋白药物——PEG修饰 抗体人原化修饰：嵌合体（人-鼠嵌合抗体） 第一节 蛋白质的化学修饰 概念 蛋白质侧链基团的修饰反应 基于蛋白质片段的嵌合修饰 蛋白质专一性修饰 蛋白质的PEG修饰 一、概念 1、蛋白质的化学修饰： 凡通过化学基团的引入或删去，使蛋白质侧链基团的共价键发生改变的过程，通称为蛋白质的化学修饰。 修饰的主要部位：蛋白质侧链基团（残基侧链） 2、影响因素（3方面因素——）（1）蛋白质功能基团的反应性 （2）蛋白质功能基团的超反应性（3）修饰剂的反应性 （2）超反应性及影响因素 超反应性 蛋白质的某个aa残基的侧链基团与个别试剂能发生非常强烈反应的特性——称为~ 。 例如，木瓜蛋白酶中的19个酪氨酸残基（Tyr）， 只有其中1个Tyr能与二异丙基氟磷酸酯（修饰试剂）反应 其它相同aa侧链基团反应性要差。 每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定的试剂显示出超反应性。WHY？ 超反应性的影响因素 需要指出的是：超反应性可能是由于一个或几个因素综合作用的结果 与特定基团所处的环境有关 二、蛋白质侧链基团的修饰反应 2、蛋白质化学修饰的研究过程 3、蛋白质的化学修饰 （1）修饰反应专一性的影响因素 （2）修饰反应专一性的过程控制 ③ 化学修饰结果的解释 （1）蛋白质侧链的功能基团 ① 羧基的化学修饰 3、专一性不可逆作用和竞争性可逆作用的区别 亲和试剂具有活泼基团，与结合部位共价连接。 竞争性试剂不具备该活泼基团，未发生共价连接。 5、亲和标记的类型（3种——依据作用方式） Ks型：亲和试剂具有底物结构相似的结合基团，同时具有与活性部位残基反应的活性基团。 Kcat型：具有底物相似的结构，还有一个潜伏的反应基团，经酶催化，活性基团活化，与活性部位发生不可逆结合。 光亲和标记——具有光活性基团。 在黑暗条件下与活性部位特异性结合，光照——试剂被激活， 产生高活性的功能基团与蛋白活性部位的侧链发生反应。 图示—亲和标记 四、蛋白质的PEG修饰 mPEG 三嗪类衍生物 mPEG（单甲氧基PEG） mPEG三嗪类衍生物包括： 1 mPEG1：2-(o-methoxypolyethyleneglycol) 2 mPEG2：2，4-(o-methoxypolyethyleneglycol) 降低或消除了酶的抗原性； 提高了酶的抗蛋白酶水解能力 延长了酶在体内的半衰期，提高了药效。 PEG修饰的其他例子 弹性蛋白酶 葡萄糖醛酸苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、腺苷脱氨酶 超氧化物歧化酶（SOD） 辣根过氧化物酶 过氧化氢酶 五、基于蛋白质片段的嵌合修饰 应用： 彼此分开的两肽段，通过二硫键、肽键或其它共价键连接在一起，形成新的蛋白质分子。 如：还原剂打开二硫键，分离，对其中一条肽链进行修饰，再混合在一起，重新形成二硫键，形成嵌合分子。 理解了胰岛素、抗体结构和功能的关系。 嵌合修饰举例： 结构域不同的肽段连接在一起：具有二者的功能 如：Fab（不同的）→F(ab)2，形成嵌合抗体（蛋白质） 利用活化酯将一条肽链连接到另一个肽链的N末端的方法 —NH—CH(Rn)CO—O—R + H2N—CH(Rn-1)CO— ↓ —NH—CH(Rn) CO— HN —CH(Rn-1)CO— 蛋白质化学修饰的应用 本节小结 蛋白质的化学修饰 蛋白质侧链基团的修饰反应 蛋白质专一性的修饰 蛋白质的PEG修饰 基于蛋白质片段的嵌合修饰 思考题 蛋白质化学修饰的反应类型有哪些？ 蛋白质化学修饰的主要部位是什么？ 什么是位点专一性修饰？ 亲和标记及其分类，与竞争性可逆作用的主要区别是什么？ 蛋白质化学修饰的目的和意义？ 肽链中出现切开，蛋白质三维结构和生物活性还能保持吗？若变性和复性会发生什么现象，这一现象有何意义。 提高蛋白质药物体内稳定性的策略。化学修饰？如何修饰？举例