沙冬青抗寒基因的克隆、功能分析及遗传转化研究.doc

沙冬青抗寒基因的克隆、功能分析与遗传转化研究 （作者：刘美芹，导师：尹伟伦教授’端RACE扩增，得到全长806bp的类脱水素基因AmCIP，并进行了序列结构分析和功能预测。经基因组DNA扩增及序列分析发现该基因没有内含子。Northern 杂交结果又表明AmCIP基因在对照材料中几乎没有表达，而在低温驯化植株中却有大量表达，在驯化植株胚根中的表达量又明显高于子叶中的表达量。可见AmCIP的表达与沙冬青抗寒力的提高直接相关，尤其是能提高较幼嫩脆弱的胚根的抗寒力。 为进一步鉴定AmCIP的功能，将AmCIP分别连接到35S启动子和rd29A启动子（Prd29A）下游，构建双元表达载体，并采用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草。转基因烟草的基因组PCR扩增, Southern及Northern杂交分析均证明目的基因已整合进烟草基因组中并且能在烟草细胞中表达。对T0代的多个转基因株系的低温抗性检测发现低温下（-2℃～4℃）转基因烟草株系的离子渗漏率降低，膜稳定性增强，零下2℃处理后的存活率增加，尤其是转Prd29A-AmCIP组合的株系。可见AmCIP的异位表达能明显提高植物的低温抗性，AmCIP可能具有低温保护蛋白功能，能在低温下保护细胞大分子及质膜的稳定性。由于AmCIP是类脱水素基因，推测能保护植物细胞抵抗水分胁迫。对叶片的保水力测定结果发现，转基因烟草离体叶片的保水力比野生型烟草的保水力增强。PEG与NaCl处理过程中转基因烟草的生长状况优于野生型烟草，而且长时间处理后存活的转基因烟草叶片都有发达的栅栏组织，细胞排列致密的海绵组织和排列整齐紧密的表皮细胞。由此可见，AmCIP的确能保护细胞免受脱水胁迫，协助维持细胞的正常生理功能。另外，为检测转基因烟草的遗传稳定性，将T1代转基因烟草的种子在低温，PEG及NaCl胁迫条件下培养，发现其萌发率及生长量均优于野生型烟草，暗示AmCIP基因的整合及表达能正常遗传。也进一步证明类脱水素AmCIP基因的异位表达能稳定提高转基因烟草对低温、干旱及盐碱等非生物胁迫的抗性。 为进一步鉴定AmCIP的可能作用机制，将AmCIP和报告基因GFP融合构建了双元表达载体AmCIP::GFP并转化了烟草。在激光共聚焦显微镜下观察发现转基因烟草的细胞质和细胞核中都有绿色荧光信号，尤其是细胞核中，荧光很强，说明AmCIP可能分布在细胞质、细胞核或结合在膜上（包括核膜），在低温下起保护膜及大分子的作用。 为鉴定AmCIP的低温保护功能，构建了AmCIP原核表达载体并转化大肠杆菌，诱导后目的蛋白能超量表达。对粗提菌液蛋白通过几丁质柱纯化，竟SDS电泳获得了单一条带的21kD蛋白。将过柱纯化的蛋白煮沸十分钟后，电泳结果仍显示有单一条带的21kD蛋白；将纯化前的粗提蛋白煮沸后也同样能得到单一条带的21kD蛋白，说明AmCIP具有热稳定性。AmCIP在SDS电泳迁移滞后的特性与其热稳定特性都是脱水素的特性，这进一步证明了AmCIP是类脱水素蛋白。纯化后的AmCIP还能提高低温条件下细菌的存活率，说明该蛋白对细胞具有低温保护功能。 将构建好的目的基因上游是rd29A诱导型启动子的双元表达载体转化三倍体毛白杨。经基因组PCR鉴定，初步确定目的基因已整合进再生毛白杨植株中。荧光显微镜观察发现转有融合AmCIP::GFP的再生植株的叶片和根中均有绿色荧光出现，说明Prd29A-AmCIP::GFP融合片断已整合进毛白杨的基因组中。 总之，本文研究获得了多个沙冬青低温诱导基因，揭示了沙冬青低温抗性的提高是一个复杂的分子生理过程，是多种代谢途径多个基因协调作用的结果。主效基因AmCIP转化烟草异位表达表明AmCIP能提高植物对低温、干旱及高盐的抗性；亚细胞定位分析发现AmCIP可能是在细胞质和细胞核中起保护作用；原核表达分析进一步验证了其保护功能。这些结果对深入探讨木本植物的抗寒性调控机制提供了理论依据；低温诱导基因的克隆、AmCIP的鉴定及转化研究为林木花卉抗寒良种选育及生物工程定向育种提供了基因资源和技术支持。 关键词：沙冬青，低温诱导基因，扣除杂交，遗传转化，烟草，三倍体毛白杨 Cloning and characterization of cold-inducible genes of Ammopiptanthus mongolicus （Liu Meiqin Directed by Prof. Yin Weilun） Abstract Low temperature is one of major abiotic stresses that affect plant growth and distribution. Many species of plants are capable of adapting to l