∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法建立.PDF

226 2015, Vol.36, No.20 食品科学 ※安全检测 基于内参的大肠埃希氏菌O157 H7实时荧光 ∶ 定量PCR快速检测方法的建立 王建昌，王金凤，段永生，李 静，陈志敏，陈瑞春* （河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北石家庄 050051 ） 摘  要： rfbE Flic 针对大肠埃希氏菌O157 ∶H7 和 靶基因保守序列，设计特异性引物和探针，优化反应体系，并加入 内参（internal amplification control ，IAC ），建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应（polymease E. coli μL chain reaction ，PCR ）检测方法。结果表明，该方法对 O157 ∶H7基因组DNA 的最低检测限为1 pg/ ；对含有 3 μL 3 靶基因质粒的最低检测限为10 copies/ ；对细菌的最低检测限为5 ×10 CFM/mL ；Ct值与模板拷贝数均呈良好的 线性关系（R2=0.999 ）。人工污染实验结果表明，在初始菌量为7 CFM/25 g 时，采用水洗加试剂盒法提取DNA ， E. coli O157 ∶H7在增菌6 h后即可检出；而采用水煮法提取DNA，则在增菌10 h后方可检出。建立的E. coli O157 ∶H7实 时荧光定量PCR方法，既能有效检测食品中O157 ∶H7，又能实时监测PCR反应过程，有效防止“假阴性”的发生。 rfbE Flic 关键词：大肠埃希氏菌O157 ∶H7 ； ； ；实时荧光定量PCR ；内参  Development of Real-Time Quantitative PCR Assay for the Detection of E. coli O157:H7 Based on Internal Amplification Reference WANG Jianchang, WANG Jinfeng, DUAN Yongsheng, LI Jing, CHEN Zhimin, CHEN Ruichun* (Technology Center of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shijiazhuang 050051, China) Abstract: Based on the rfbE and Flic genes of Escherichia coli O157:H7, the specific primers and probes were designed, and a real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) was developed. An internal amplification control (IAC) was added to the reaction system to monitor the performance of reaction system. The assay could be used reliably to