蛋白质组学研究技术剖析.pptVIP

School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * 2. 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation ， Co-IP）耦联质谱技术 利用靶蛋白 X 的抗体免疫沉淀 X，同时将与 X在体内结合的蛋白质 Y 也沉淀下来，分离后经质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。 常将 HA 或 FLAG 作为 X 蛋白的纯化标签。 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * 二、酵母双杂交（Yeast two-hybrid ）技术 典型的真核转录因子都含有二个结构域: DNA结合结构域和转录激活结构域。 二个结构域只有结合才具完整活性。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * 以酵母半乳糖苷酶转录因子GAL4为例说明酵母双杂交技术的基本原理 三、噬菌体展示 (phage display) 技术 将外源蛋白的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白（P3, P8, 或 P6）融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。利用配基（抗体或受体等）亲和吸附表达靶蛋白的噬菌体颗粒，获得靶蛋白的基因序列。 外源蛋白 外源基因 P6和P3 P8 P9和P7 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * 噬菌体展示技术的优点： 展示的外源蛋白具有生物学活性； 利用亲和吸附可将极稀少的靶克隆富集出来，并且不必对配基的结构有深入了解，大大扩展了该项技术的使用范围； 外源靶蛋白及其编码基因统一于同一个噬菌体内，极大方便了对基因序列的研究。 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * 生物质谱技术与蛋白质鉴定 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * 一、质谱（Mass spectrometry, MS）的基本原理 将样品分子汽化并电离成离子，通过测定离子的质荷比（m/z）和强度来进行定性和定量分析。 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * Inlet Ionization Mass Analyzer Mass Sorting (filtering) Ion Detector Detection Ion Source ? Solid ? Liquid ? Vapor Detect ions Form ions (charged molecules) Sort Ions by Mass (m/z) 1330 1340 1350 100 75 50 25 0 Mass Spectrum 图片来自网络 有机分子受到电子轰击后，会断裂形成不同的多种离子，得到的质谱图称为标准质谱图，也叫棒图。 10 0 80 60 40 20 0 20 40 10 0 80 60 分子离子峰 基峰 相对强度（％） 质荷比（m/z) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * 强度最大的质谱峰称为基峰，设其强度为100％，其它质谱峰与基峰比较，得到相对强度。质谱图中由分子失去一个电子形成的离子的峰称为分子离子峰，据此可直接得知样品的分子量。 二、生物质谱 （biological mass spectrometry, BMS） 离子源和质量分析器是质谱仪最重要的两个部件，也是不同质谱仪的主要差别所在。 ESI 和 MALDI 为离子源的质谱技术广泛应用于生物大分子研究，因此被称为生物质谱。 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College * （一）离子源 使样品分子电离成离子，并把离子加速后引入质量分析器。 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College