发酵4项目四：菌种的扩大培养.pptVIP

将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短 生理形状稳定 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求 无杂菌污染 保持稳定的生产能力 实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段 液体培养 适于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种 好氧培养。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子接入种子罐，如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌 厌氧培养。对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下： 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐 实验室制备的摇瓶种子还不能满足生产所需要的足够数量的种子，因此，摇瓶种子仍需要在小型发酵罐中继续培养 由于其目的是培养种子，为有别于生产产物为目的的大发酵罐，一般把用来培养种子的小型发酵罐称为种子罐。 通过种子罐逐级培养，然后向发酵罐大量地接入培养成熟菌种可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率；节约了发酵培养的动力消耗；并有利于减少染菌机会。 斜面菌种培养 不宜多次移种。一般只移接三次，防自然变异。 活化斜面中加0.1%葡萄糖。 培养基特点：原料较精细。 摇瓶培养 三角瓶进行，液体恒温振荡，即摇瓶，摇瓶培养为一级种子培养。 培养基特点：使用的原料基本接近于发酵培养基。 种子罐培养 种子罐大小根据发酵罐大小和接种量确定。培养基组成与发酵罐培养基基本一致，但所含的配比量可有差异。 培养基的特点：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，更接近于发酵培养基。 种子制备过程中，因菌种不同，可采用不同种子罐级数。种子罐级数是指制备种子需要在种子罐中逐级扩大培养的次数。 一般根据种子罐从小到大的顺序，将最小的称为一级种子罐，次小的称为二级种子罐，依次类推。其它依次类推。 级数的确定一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子生产。 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会；但种子级数太少，则接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会。 原材料质量波动 四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同，对孢子影响也不同，如鱼胨或骨胨 温度 湿度 通气量 种龄 接种量 菌体形态 生化指标 测定种子液中糖、氮、磷的含量,pH变化来确定种子的质量 产物生成量 酶活力 种子液中，某种酶的活力与目的产物的产量密切相关， 因此，可以间接反映种子的质量 将斜面种子或米孢子接入含液体培养基的锥形摇瓶（又称三角摇瓶）中，于摇床上恒温振荡培养，获得液体种子，叫摇瓶种子。摇瓶种子可在摇瓶种传代，第一代为母瓶，第二代称为子瓶。 培养基配制 分装 接种:孢子悬液或斜面种子 培养 保存 培养基配制 摇瓶培养的目的是获得具有较强生命力的营养菌体，因而摇瓶培养基应全面、均衡和丰富，以便充分满足菌体的生长和对各种营养物质的要求。 配制时要考虑营养成分中生理酸、碱性物质的平衡搭配或加入磷酸盐、碳酸钙等缓冲剂来控制培养过程中的pH变化。摇瓶种子在培养过程中一般不便于调节pH。 分装和灭菌 三角摇瓶用棉塞或泡沫塑料棉塞，置高压灭菌器中灭菌。装量要适当，以保证良好的通气 一般情况下，参考装量为40～50 ml/ 250 ml瓶，60～80 ml/ 500 ml瓶，90～110 ml/ 750 ml瓶，120～150 ml/ 1000 ml瓶； 厌氧培养，则装量应增加一倍以上。灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在瓶塞或纱布上。 接种 一般采用斜面种子挖块法或米孢子粒计数法。这种方法难于掌握接种量，从而影响摇瓶种子的质量。 为此可以采用用无菌蒸馏水将斜面种子或孢子制成细胞或孢子悬液，然后按一定体积或一定细胞或孢子数接种至摇瓶培养基中。 在一定的体积接种之下，活菌量越多，意味着下一级种子的接种量越大，下一级种子生长越快。 但菌体浓度也不能太高，否则影响摇瓶中的菌体对营养成分的竞争及气体交换，降低菌体生长质量。 恒温振荡培养 注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。 注意摇床中心与边缘、上层与下层的温差，一般摇床上层的温度高于下层，中间的温度高于边缘。 为避免不同位置上摇瓶种子质量的波动，培养时，最好在具有相同温度带的摇床固定位置上进行。 培养时间一般应将摇瓶种子的生长阶段控制在对数生长的后期。可通过观察外观粘稠度、静置沉降量或测定离心湿菌体体积以及显微镜检查进行