南昌大学第十章酶与细胞的固定化技术.pptVIP

第十章 酶和细胞的固定化技术及其应用 微生物酶 菌体内酶与菌体外酶 2 菌体外酶 10.2 酶的特性 1 酶的催化性 2 酶的专一性 2 酶的专一性 3 影响酶反应速度的因素 (2) 氢离子浓度 纵上所述，直接利用微生物酶—— 固定化酶的历史 酶固定化后的性质变化 2 常用方法——物理吸附法 物理吸附法固定化酶举例 制备方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法） 4. 聚乙烯醇包埋法 磷酸盐硬化法,循环冷冻法,硼酸硬化法 硼酸硬化法: 将聚乙烯醇在70℃~ 80℃进行水浴加热至完全溶解,然后冷却至35℃,与酶溶液(细胞悬浮液)混匀,滴加到饱和硼酸溶液中 优点: 原材料价格便宜 条件温和 无毒害作用 格子型包埋法制备的固定化酶 二 微型胶囊法 （2）方法—— （3）微型胶囊法优缺点 10.1.3 交联法 酶网载体交联法 10.1.4 化学共价法 定义：共价法就是使非水溶性载体与酶以共价键的形式结合. 优点:载体与酶结合牢固,半衰期较长 缺点:化学共价法结合时反应剧烈,引起酶蛋白高级结构发生变化,回收率较低。 10.1.4 化学共价法 用于共价法固定的酶蛋白上的功能基团: 1.氨基-赖氨酸上的ε-氨基以及多肽链N末端氨基酸上的α- 氨基; 2.羧基-双羧基氨基酸:门冬氨基酸和谷氨酸上的游离羧基,以及多肽链末端的α- 羧基; 3.酪氨酸上的苯酚环; 4.半胱氨酸上的巯基; 5.羟基-丝氨酸,苏氨酸以及酪氨酸上的羟基 6.组氨酸上的咪唑基; 7.色氨酸上的吲哚基 其中以氨基和羧基为最常用 对于共价偶联反应的选择一般应考虑到酶蛋白上供共价结合的功能基团必须不影响酶的催化活性 共价法的主要方法: 酰化反应：羧基经碳化二亚胺活化， 芳化反应：氨基经3-氟-4,6-二硝基苯基芳化 烷基化反应:巯基,氯化三嗪为活化剂,多糖为 载体 溴化氰法:氨基 重氮化反应:芳氨基 硅烷基化法:载体为多孔玻璃或多孔陶瓷,胰蛋白酶,凝乳蛋白酶、核糖核酸酶等 4 固定化酶的制法及其特性比较 10.1.5 逆胶束酶(reversed micelles)反应系统 逆胶束是表面活性剂等两性分子在有机溶剂中自发形成的聚集体 逆胶束酶作为有机相反应的催化剂大大扩大了酶的工业应用 用于逆胶束酶系统的表面活性剂有：琥珀酸二辛酯磺酸钠(AOT),溴代十六烷基三甲铵(CTAB),氯化三辛甲铵(TCMAC),磷脂酰胆碱(PTEA),以及磷脂酸等,其中以AOT为最常用. 作为逆胶束系统的有机相可以用：环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油等有机溶剂 制备逆胶束酶系统的方法： 最常用的方法是将一个含酶水溶液注入到含表面活性剂的有机溶剂中去，然后进行搅拌直到形成透明的溶液为止。此法可很好地控制逆胶束中水核的大小和含量。 第二种方法是相转移法。将酶从主体水溶液中转移到含表面活性剂的有机溶剂中形成逆胶束酶溶液。此法可得到较高的酶浓度。 第三种方法是逆胶束溶液与固体酶直接搅拌，使酶进入逆胶束内。此法所需时间长，酶变性失活较严重。 逆胶束酶系统中有机溶剂的作用 1.如果合成反应的产物在水中溶解度很小而易溶于有机溶剂，那么有机溶剂存在会改变原来的反应平衡，使合成反应趋于完成。 2.产物如有抑制作用，其抑制程度与产物的浓度有关，因此产物在有机溶剂中的溶解将会减轻产物的抑制程度。 3.如果水能与反应底物、产物或其它物质起反应形成副产物，那么有机相中反应可以减少副产物并提高反应收得率。 4.一般来说，酶的热稳定性与水化程度有关，不完全水化的酶其热稳定性往往较高，因此有机溶剂的存在将改善酶的热稳定性。 逆胶束酶反应系统的应用 芳香族异构体混合物的选择性氧化 甘油三酯或二酯的酯键选择性修饰 10.4 固定化菌体 一、 包埋法 包埋法制备固定化菌体应用举例 二、 载体结合法（吸附法） 载体结合法制备固定化菌体举例 操作方法： 在含酶（或细胞）的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲撑双丙烯酰胺； 然后在催化剂（二甲氨基丙腈）和引发剂（过硫酸钾）的作用下低温（水浴）聚合； 产生的聚合物凝胶便是固定化酶，可通过机械方法分散成一定大小的粒子。 酶液 丙烯酰胺 N，N－双丙烯酰胺 氢气 催化剂：四甲基乙二胺、明矾胺 引聚剂： 过硫酸钾、核黄素 光照 聚合反应 凝胶酶块 固定化酶 切割 青霉素酰胺酶 胆碱酯酶 α、β－淀粉酶 葡萄糖氧化酶 乳酸脱氢酶 酶 琼脂 淀粉 聚丙烯酰胺凝胶 凝