关于数字PCR的报告 方昊.ppt

中国科学院苏州医工所(筹)科研工作汇报 * 关于数字 PCR 发展、原理、运用和前景 调查汇报 2017年3月 * 数字 PCR(digital PCR,dPCR) 技术是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术。与传统定量 PCR 技术不同的是数字 PCR 不依赖于扩增曲线的循环阈值(CT值)进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，是对起始样的绝对定量。 * 主 要 内 容 数字 PCR 的发展与原理 数字 PCR 的应用 3 1 2 数字 PCR 的前景展望 * 数字PCR的发展与原理 20 世纪末，Vogelstein 等提出数字 PCR 的概念，通过将一个样本稀释后分成几十到几万份甚至上千万份，然后分配到不同的反应单元，每个单元不包含或包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行 PCR 扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。【1】 2006年美国 Fluidigm 公司率先推出第一款数字 PCR产———基于 IFC（integrated fluidic circuit ）技术的 BioMarkTM。 2009年，BioTrove 被 Life Technologies (Applied Biosystems) 收购。 QuantaLife公司开发出的微滴数字PCR技术。该产品还获得了2011年度Frost Sullivan北美新产品创新奖。同年 Bio-Rad 收 购 QuantaLife 的液滴数字 PCR 技术(ddPCR)，迅速推出 QX100 液滴数字 PCR 产品。 * * 传统 PCR 或定量 PCR 反应都是在 96 /384 孔板中进行的，因此早期的数字 PCR 技术也采用 96 /384孔板作为反应单元。这远远不能满足数字 PCR对反应单元数的需求，于是开始制造微升和纳升级别的反应室，在提高灵敏度的同时减少了反应体系的总体积。 1.微反应室/孔板数字 PCR * 2.微流控数字 PCR 随着微流芯片技术的发展，数字 PCR 借助微流芯片，可以把样本准确并且快速的分成若干个独立的反应单元，各个单元之间互不影响，可以多步反应同时进行。提高反应通量的同时也降低了反应消耗成本。 * 3.微滴数字 PCR 微滴数字 PCR 借鉴了乳液 PCR，即将 DNA 模板与连接引物的磁性微球以极低的浓度(比如单拷贝) 包裹于油水两相形成的纳升至皮升级液滴中进行 PCR 扩增，扩增后的产物富集在磁性微球上，收集破乳后进行测序。通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的 PCR 反应体系，比微孔板和 IFC 系统更容易实现小体积和高通量，而且系统简单，成本低，因此成为理想的数字 PCR 技术平台。【2】 数字PCR的应用 * 数字 PCR 的前景展望 发展空间大 数字 PCR 与传统 PCR 不同它有多种运作方式和原理，数字 PCR 技术还有很大的发展空间。在其运用方面，也可有有很大的拓展空间。因为他是对核酸的绝对定量，是一种更加直观、精确的 PCR 技术，在未来的研究中，数字 PCR 肯定会有更大的发挥空间。 * 数字 PCR 的前景展望 高需求并有小众化趋势 因为数字 PCR 在各项领域的突出表现，数字 PCR 的需求越来越迫切。例如：现在许多医疗机构提供DNA水平的疾病（主要为癌症）筛查服务，并为癌症患者提供靶向药品，虽然国内只有少数医疗机构提供该服务，但是需要这项服务的人却很多。 * 数字PCR的前景展望 发展中的难点 成本高 通量低 对引物有要求 DNA 聚合酶质量要求高 严控污染 * [1]林彩琴,姚波. 数字PCR技术进展[J]. 化学进展,2012, (12): 2 415-2423. [2]詹成,燕丽,王琳,金玉麟,陈力,时雨,王群. 数字PCR技术的发展和应用[J]. 复旦学报(医学版),2015,(06):786-789. [3]Holmberg RC,Gindlesperger A,Stokes T,et al.Akonni TruTip(R)and Qiagen(R) methods for extraction of fetal circulating DNA-evaluation by real-time and digital PCR.PLoS One,2013,8:e73068. [4]Gu W,Koh W,Blumenfeld YJ,et al.Noninv