第5章酶学研讨.ppt

LDH同工酶有组织特异性，LDH1在心肌含量高，而LDH5在肝、骨骼肌含量高。因此，LDH同工酶的相对含量的改变在一定程度上反映了某器官的功能状态，临床上利用这些同工酶在血清中的相对含量的改变作为某脏器病变鉴别诊断的依据。 同工酶也是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分化和癌变的有力工具，在酶学、生物学、和医学中均占有重要地位。 LDH1(H4) LDH2(H3M) LDH3(H2M2) LDH4(HM3) LDH5(M4) 心肌 肾 肝 骨骼肌 血清 - + 原点 不同组织中LDH同工酶的电泳图谱 同工酶在各学科中的应用 (1) 遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。 (2) 发育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况，以及个体发育和系统发育的关系。 (3) 生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而解释它们代谢功能的差别。 （4）医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。 四、固定化酶 将水溶性酶用物理或化学方法处理，固定于高分子支持物(或载体)上而成为不溶于水，但仍有酶活性的一种酶制剂形式，称固定化酶(immobilized enzyme)。 包埋法 吸附法 共价偶联法 交联法 第五节 酶的纯化及活力测定 3.5 酶 的分离纯化及活力测定 一、酶的分离提纯 （一）酶在细胞中的分布： 胞外酶：水解酶类，易收集，不必破碎细胞，缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液。 胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。 （二）分离材料： 动植物原料或微生物的发酵液。微生物发酵液是用于分离酶的最常用材料，因为微生物种类多，繁殖快，培养时间短，含酶丰富。由微生物发酵产生的酶或其它生物组织中的酶因含有大量的其它物质，所以必须经过分离、提纯、结晶等阶段才可做实际应用。 对于某种酶的具体制备方案，应通过了解酶的来源、性质及纯度需要来确定，无固定的方案。 （三）原则： 在增加酶得率和纯度的同时，尽可能避免高温、过酸、过碱、剧烈的震荡及其它可能使酶丧失活力的一切操作过程。尽最大可能保存酶的活力。 （四）分离提纯： 1.酶的抽提：将酶溶解出来就称为抽提。 胞外酶：固体培养的菌体加水或适当缓冲溶液浸泡过 滤即可。液体培养的菌体将发酵液离心分离除去菌体收 集离心液即可。 胞内酶：先破碎细胞，再用水或适当的缓冲溶液抽提。 2. 酶的纯化： 纯化的关键是维持酶的活性，因为随着酶的逐渐提纯，一些天然的可保持酶活力的其它成分逐渐减少，酶的稳定性变差，所以整个纯化过程应维持低温。 （1）酶的沉淀方法：与蛋白质的沉淀方法相同，常用： ① 盐析法：常用硫酸铵盐析，有分段盐析和一次性盐析两种方法。 ② 有机溶剂沉淀法：用乙醇、丙酮等。应低温操作，溶剂少量分批加入。 ③等电点沉淀法 （2）酶的纯化方法： 有吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层 析等 . 3.酶的结晶： 纯化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。 4.酶的保存： 一般在-20℃以下低温保存。 二、酶活力的测定 定性鉴定提取物中某一酶是否存在，一般是根据此酶引起的化学反应来判断，如检验在提取物中是否存在淀粉酶。则用提取物与淀粉反应，一段时间以后，用碘-碘化钾与反应液反应，若变蓝，说明提取物无淀粉酶活力；反之，提取物有淀粉酶的活力。 酶活力的测定：实际上是酶定量测定的方法，酶制剂因含杂质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。 （一）酶活力的概念： 指酶催化特定化学反应的能力。其大小通常用在一定条件下酶催化某一特定化学反应的速度来表示。一定量的酶制剂催化某一化学反应速度快，活力大；反之，活力小。速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，测初速度，多用后者。因为反应初期底物过量，底物的减少量不容易测定，而产物从无到有，易测定。 （二）酶的活力单位： 1961年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（IU）规定为：在最适反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位。 测定条件：最佳的反应条件，如最适的T（或25℃）、最适pH、[S] [E]、初速度下。 1972年国际生化协会又推荐一种新单位，即Kat