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　　BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用论文 白玉杰，Seetha SV， Vamla B, 高庆生 【关键词】 乳腺肿瘤 Interaction betain only protein FHL2 【Abstract】 AIM: To screen genes encoding proteins , confirm the interaction and analyze their functional linkage. METHODS: 3′region of BRCA2 gene id and to screen the cDNA library of normal human mammary gland. Coimmunoprecipitation, mammalian tonstrated by coimmunoprecipitation, mammalian ted and s; genes, suppressor, tumor; BRCA2; yeast t）；哺乳细胞双杂交系统质粒(pM, pVP16, pM53, pVP16T, pVP16cp）；酵母培养基（YPDA）及筛选培养基（SD）、多种氨基酸、XαGal, XβGal, LB培养基、酵母质粒DNA提取kit（clontecl#K16111）等购自CLONTECH 公司；293T细胞购自ATCC（美国组织培养中心）. 1.2方法 1.2.1酵母双杂交系统‘钩’质粒的构建以pUC19/BRCA2质粒（哈佛大学Sam Lee博士惠赠）为模板，采用Stepdo3 Libraries User Mannual. PT32471, Clontech, USA). 1.2.3哺乳细胞双杂交方法验证BRCA2/FHL2体内结合将BRCA2/C3片段及FHL2基因分别克隆到哺乳细胞双杂交载体pM和pVP16中，Ca3（PO4）2沉淀法转染293T细胞，CO2孵箱37℃培养48 h，收集细胞，采用荧光酶检测试剂盒（CLONTECH公司）检测转染细胞的荧光酶活性. 1.2.4免疫共沉淀法分析FHL2与BRCA2的体内结合分别构建表达含Flag标签的C3和含Myc标签的FHL2的真核载体pEF/BRCA2C3flag (pEF/BRCA2C1/C2两个质粒编码较短的C端片段作为对照)和PCR3.1/FHL2myc, 各用10 μg氯化铯纯化的质粒DNA，磷酸钙沉淀法转染293T细胞. 48 h后收集细胞,用含10 g L-1 FMSF的LSAB缓冲液溶解，振荡、离心取上清，加入10 mg L-1 抗Flag单克隆抗体（M9, Sigma公司）4℃孵育过夜， 加入蛋白G微珠, IP缓冲液(50 mmol L-1 TrisHCl PH8.0, 150 mmol L-1 NaCl, 5 mg L-1 NP40, 0.1 g L-1 BSA, 10 mg L-1 PMSF)漂洗6次, 90 mg L-1 SDSPAGE电泳，转移到尼龙膜，用辣根过氧化物酶偶联抗Myc单克隆抗体（Sigma公司）进行/FHL2, pEF/BRCA2真核表达载体和pG5luc荧光酶报道质粒共转染293T细胞，CO2孵化37℃培养48 h，用荧光酶检测试剂盒测定转染细胞的荧光酶活性. 2结果 2.1酵母双杂交筛选质粒的构建pUC19/BRCA2质粒为模板，Stepdoin， 68℃/65℃/62℃/59℃/56℃ 1 min, 72℃ 2 min 各5个循环，随后94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min 进行20个循环. PCR产物经10 mg L-1琼脂糖凝胶电泳检测，特异性扩增产物分子质量(Mr×103)约为2900，与设计扩增大小相符. PCR产物与经酶切pGBKT7, pGADT7质粒，经连接转化、提取质粒DNA，双酶切鉴定阳性重组质粒，序列测定证实正确. 2.2cDNA文库的酵母双杂交筛选用pGBKT7/ C3酵母双杂交‘钩’质粒筛选正常人乳腺细胞cDNA文库，转化效率为0.8×106~9.2×107 cfu μg-1 DNA，筛选获得阳性克隆68个，BLAST分析在24种已知基因中，包括编码FHL2蛋白的基因全长序列. 2.3哺乳细胞双杂交分析pM/C3，pV16/FHL2, pM/FHL2, pV16/C3各10 μg；荧光酶表达报道质粒pG5luc 2 μg共转染293T细胞, 通过检测荧光强度分析蛋白间的相互作用，结果表明FHL2与BRCA2C3片段特异性结合（Fig 1. pMFHL2+ pVP16C3 共转染293T细胞，LA=3122.2，PMC3+pVP 16FHL2 共转染293细胞，LA=2941.1）；FHL2有自身的内在转录