B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达论文.docVIP

　　B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达论文 程海，徐开林， 孙海英， 杜冰， 曾令宇， 鹿群先， 何徐彭， 潘秀英 【摘要】 本研究目的是构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体.freelRNA。感染后24、48、72小时检测到细胞上清中FⅧ活性(FⅧ∶C)分别为12%、43%、87%。PCR法扩增出了534 bp的特异性片段。结论： 成功构建的慢病毒表达载体pXZ208BDDhFⅧ，在体外可以有效感染293T细胞并表达有活性的FⅧ，提示基因治疗可应用于血友病A。 【关键词】 慢病毒 Expression of B DomainDeleted Human Coagulant Factor Ⅷ Gene in 293T Cells Mediated by Lentiviral Vector In Vitro Abstract This study ed to construct a lentiviral vector carrying human coagulant factor Ⅷ (FⅧ) and to investigate its expression in 293T cells. Bdomaindeleted factor Ⅷ gene fragment (BDDhFⅧcDNA) e digestion and cloned into lentiviral vector pXZ208 to establish the expression vector pXZ208BDDhFⅧ. Rebinant viral particles id ΔNRF and envelope plasmid VSVG using calcium phosphate precipitation method. 293T cells RNA and genome integration ethod, RTPCR and PCR after transfection. The results shoed that the activity of FⅧ the infected cells. The gene integration in the targeted cells an FⅧ in 293T cells, ay provide a potential application of gene therapy to haemophilia A. Key atol 2007; 15(5)B区缺失的人凝血因子Ⅷ在293T细胞中的表达司。各种工具酶、1 kb DNA Ladder、质粒小量提取试剂盒（Plus SV Minipreps DNA Purification System）、质粒中量提取试剂盒（PureYieldTM Plasmid Midipre System）、目的基因纯化试剂盒（ PCR DNA Purification System）、线性化载体回收试剂盒（ DNA CleanUp System）、反转录试剂盒（Access RTPCR System）、 PCR扩增试剂盒（PCR Master Mix）、RNA提取试剂盒（RNAgents Total RNA Isolation System）均购自Promega 公司。Factor Deficient Plasmas 购自美国的Pacific Hemostasis 公司。 慢病毒表达载体的构建和鉴定 采用限制性内切酶Xhol I 单酶切载体pDLZ6，得到4 435 bp的目的基因BDDhFⅧcDNA，低熔点凝胶回收后插入到慢病毒载体pXZ208的Xhol I位点，Xhol I、Kpn I 单酶切鉴定重组子。将正确连接的重组子命名为pXZ208BDDhFⅧ。 细胞培养 DMEM加10% FBS常规培养293T细胞,每2-3天 换液1次,胰酶消化传代,倒置显微镜下观察细胞的生长状况。 重组慢病毒的包装 采用磷酸钙共沉淀法［4］将重组质粒pXZ208BDDhFⅧ(15 μg)分别与包装质粒ΔNRF(10 μg)、包膜蛋白质粒VSVG(5 μg)共转染293T包装细胞，用无血清的培养基在37℃、5% CO2条件下培养3小时后，加入FBS,使其终浓度达到10%，12小时后更换全部培养液，37℃、5% CO2条件下继续培养。72小时后收集病毒上清，过滤后-80℃保存。同时以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒载体pXZ171作为对照，观察GFP表达情况。 病毒滴度的测定 将293T细胞按照2×105/孔接种于6孔板上，吸附6小时后，将所收集的含pXZ171的病毒上清分别按对数级稀释，将1 ml稀释后的病毒上