AD5-F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究论文.docVIP

　　AD5/F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究论文 .freelatopoietic Cells of Different Origins Abstract This study ed to investigate the transfection efficiency of adenoviral vector AD5/F35 to hematopoietic malignant cells lines of various origins and AD5/F35 cytotoxicity. The hematologic malignant cell lines of various origins ultiple of infection (MOI) and AD5-EGFP etry; the killing effect of virus on infective target cells icroscopy. The results shoyeloid origin atologic malignant cells of varions origin，the infection ability of AD5/F35 vector to cells of myeloid origin is stronger than that to cells of B cell origin，the cytotoxicity of AD5/F35 vector to infective targer cells is small. The AD5/F35 vector is preferable to AD5 vector in respect of infection ability and offers good prospects of application in gene therapy for myeloid leukemia cells as target cells. Key alignant hematopoietic cell line 腺病毒载体是基因治疗中应用最广泛的病毒载体之一。传统的腺病毒载体基本都是以5型腺病毒为基础构建的，但5型腺病毒载体对造血细胞感染效率低下，在一定范围上限制了它的使用。有研究表明，用35型腺病毒的纤突蛋白改造5型腺病毒可以有效提高对造血干细胞的感染效率［1］。我们使用携带EGFP报告基因的AD5/F35载体，比较了它对不同来源的血液系统恶性细胞感染效率的差异及对所感染靶细胞的毒性作用。 材料和方法 材料 试剂 RPMI 1640培养液（Gibco公司产品），胎牛血清（Hyclone公司产品），MTT（华美公司产品）。DMSO(Sigma公司产品)。 细胞 CEM（急性T淋巴细胞白血病细胞株）、HPB-ALL（急性T淋巴细胞白血病细胞株）、Daudi（Bukitt淋巴瘤细胞株）、K562（慢性髓系白血病细胞株）均由中国医学科学院肿瘤研究所提供。 病毒 AD5-EGFP（滴度6.3×109 TCID 50/ml），AD5/F35-EGFP（滴度1.3×109 TCID 50/ml）。两病毒均由国家863病毒载体研发基地制备。 仪器 流式细胞仪（Courter公司产品），荧光倒置显微镜（Leica DLIL 德国Leica公司产品），酶标仪，CO2培养箱（Heraeus 公司产品）。 方法 感染效率检测 受试细胞在25 cm2方瓶用10% FBS培养液培养至对数生长期进行试验。将受试细胞计数后分入EP管，每管5×104细胞，体积为100 μl。分为2组，其中1组感染AD5/F35-EGFP病毒，另1组感染AD5-EGFP病毒。用无血清培养基将AD5/F35-EGFP病毒和AD5-EGFP病毒原液稀释成不同浓度的病毒的病毒悬液，分别以MOI为0、10、30、100、300、1 000加入病毒液到细胞管中混匀，37℃水浴感染2小时。1 500 rmp低速离心10分钟，弃去感染上清，用无血清培养液清洗细胞2遍，转入24孔板，用含10% FBS培养液继续培养48小时。流式细胞仪检测不同感染MOI下荧光阳性细胞比例，并且在荧光显微镜下照相。 毒性试验 受试细胞在25 cm2方瓶用10%FBS培养液培养至对数生长期进行试验。将受试细胞计数后分入96孔板，每孔1×104细胞，体积为100 μl。每种细胞设AD5-EGFP组、AD5/F35-EGFP组、空白对照组。每个病毒组设MOI为10 、100、 1 000 3个感染剂量，每个剂量设3个复孔。用无血清培养液将AD5/F35-EGFP病毒和AD5-EGFP病毒原液稀释成不同浓度的病毒悬液，每孔加入