CpG ODN增强乙肝疫苗免疫反应的研究论文.docVIP

　　CpG ODN增强乙肝疫苗免疫反应的研究论文 戴帆，董斌，郭晓磊，石碧珠，方丽娟，莫家琳，田素娟，孟民杰 【摘要】 目的 研究人工合成的CpG ODN对乙肝表面抗原的免疫增强效应.freelmunological enhancement of HBsAg s of mice munize the BALb/c mice,the highdose group could be detected quickly in shot term,the levels of antibodies in groups the levels of antibodies in groups munological effect of HBsAg s. Key munoadjuvant; humoral immunity CpG基序是一种具有非特异性免疫刺激能力的DNA序列，为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列。CpG ODN (unmethylated CpG motifbased oligodeoxynucleotide)是人工合成的含未甲基化CpG基序的寡核苷酸序列。CpG ODN可刺激人类和多种动物产生自然免疫和获得性免疫，主要通过TLR9信号系统活化免疫系统，最终促使多种免疫细胞的成熟分化和增殖，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和DC细胞。CpG ODN能快速活化T、B细胞，诱导Th1型免疫反应并能促进抗原递呈细胞的增生和成熟1。现阶段我国对乙型肝炎的预防主要是通过注射乙型肝炎疫苗，但接种免疫过程中和接种免疫后会出现免疫较弱和不免疫现象2,3。所以，选择一种安全有效的免疫佐剂是增强免疫效果的有效途径。本文通过测定不同时间段的小鼠注射CpG ODN和乙肝表面抗原后的抗体滴度，评价CpG ODN作为免疫佐剂增强乙肝疫苗的免疫效果。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物 BAL b/c小鼠，雄性，6周龄，体质量18～22 g，SPF级，购自中山大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)20040011。 1.1.2 试剂 血源性乙肝表面抗原购自上海前尘生物，CpG ODN 由本实验室保存。 1.2 动物分组及免疫方案 1.2.1 动物分组 50只BAL b/c小鼠根据随机分配表，随机平均分成5组：第1组为HBsAg和高剂量CpGODN联合免疫组，第2组为HBsAg和中剂量CpGODN联合免疫组，第3组HBsAg和低剂量CpGODN联合免疫组，第4组为HBsAg单用组，第5组为生理盐水对照组。各组饲养条件相同。 1.2.2 动物免疫 分别于第0、2、4周免疫BAL b/c小鼠，每次免疫剂量相同。第1组：尾静脉注射含2 μg HBsAg 和100 μg CpGODN生理盐水溶液，100 μL/只;第2组：尾静脉注射含2 μg HBsAg 和1 μg CpGODN生理盐水溶液，100 μL/只;第3组：尾静脉注射含2 μg HBsAg 和10 ng CpGODN生理盐水溶液，100 μL/只;第4组：尾静脉注射含2 μg HBsAg生理盐水溶液，100 μL/只;第5组：100 μL生理盐水/只。 1.3 乙肝表面抗原检测 1.3.1 血清采集 断尾后玻璃毛细管采血，室温自然凝固，常温离心后取上清，-20 ℃保存。 1.3.2 抗原检测 96孔板用碳酸氢钠缓冲液(15 mmol/LNa2CO3，355 mmol/LNaHCO3，pH 9.6)适当稀释的乙肝表面抗原包被，4 ℃过夜孵育。用含Tol/LPBS,0.1% Tin，每孔加入100 μL经PBS(0.1 mol/L PBS,1% BSA)适当稀释的待测血清， 37 ℃孵育90 min。 PBS洗涤5次， 每孔加入100 μL 1 000倍稀释的HRP标记的乙肝表面抗原，37℃孵育40 min。PBS洗涤5次，每孔加入100 μL TMB底物(含0.1 mg/mL 3’3’5’5’四甲基联苯胺的磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH 5.4，用前加5 mL 30% H2O2 10 mL)，37 ℃孵育1 h。每孔加入100 μL H2SO2(0.2 mol/L)终止显色反应。BioRad 680 测定A450/630读数。 1.4 统计学分析 应用SPSS统计软件，采用重复测量方差分析对数据进行分析，P 0.05为差异有显著性。 2 结 果 2.1 小鼠免疫后7～28 d外周血中乙肝表面抗体的平均滴度变化 乙肝表面抗原单用组的抗体在7～17 d时间段内检测不到，乙肝表面抗原和低剂量CpG ODN联合免疫的抗体在第14天检测到，乙肝表面抗原和中剂量CpG ODN联合免疫组的抗体在第10天检测到，乙肝表面抗原