CRKL基因反义寡核苷酸对K562细胞增殖的影响论文.docVIP

　　CRKL基因反义寡核苷酸对K562细胞增殖的影响论文 .freelylocytic leukemia Abstract:AIM To investigate the effects of CRKL anti-sense-oligonucleutides（ASODN）on cell groediated by cationin li-posome.The cell viability，proliferation，and gene expres-sion ined by H 3 -TdR doping and RT-PCR.RE┐SULTS CRKL ASODN could inhibit the viability and prolif-eration of K562cells.CONCLUSION CRKL gene may play a key role in the pathogenisis in Ph+ CML. 0 引言 性粒细胞性白血病（CML）是起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病.绝大多数CML具有特征的Ph染色体（Ph+ CML），有其形成的bcr-abl融合基因，编码的P210 bcr-abl 融合蛋白具有异常增高的酪氨酸激酶活性，通过异常激活RAS、JAK/STAT、JUN等激酶，引起调控细胞生长、发育的多条信号转导途径异常，从而使细胞发生恶性转化［1］ .CRKL系bcr-abl通路中一个重要接头蛋白，为bcr-abl融合蛋白激酶的主要底物之一.我们通过CRKL基因反义寡核苷酸作用于Ph+ 的K562细胞，观察对其增殖活性的影响，以探讨CRKL基因在CML发病中的作用. 1 材料和方法 1.1 反义寡核苷酸 针对翻译起始位点的反义寡核苷酸［2］ ASODN:5′-GTC GAA CCT GGC GGA GGA-3’（18bp）;无意义寡核苷酸NASODN:5′-GAA GGG CTT CTG CGTC-3′（16bp）.上述寡聚物均为全硫代修饰，由上海Sangon公司合成，纯化后-20℃保存. 1.2 阳离子脂质转染剂 美国Gibco公司产品，本校西京医院刘颖格博士惠赠.转染步骤按照产品说明书进行. 1.3 细胞系及培养条件 K562细胞由本校病理学教研室惠赠.用RPMI1640完全培养液（含100mL L-1 灭活胎牛血清），置于37℃，50mL L-1 CO2 饱和湿度的恒温孵箱中培养.实验选用对数生长期细胞.选用96孔板，分3组:ASODN组，NASODN组及空白对照组.每组设4个复孔，每孔接种细胞5×104 个.分别加入脂质体包裹的终浓度为2，3，5mg L-1 的A-SODN及NASODN，空白对照组加入相同量的培养液及脂质体.最后以浓度5mg L-1 的寡核苷酸培养细胞，分别于24，48，72，96h测细胞活性，绘制细胞生长曲线，计算细胞生长抑制率. 1.4 反义核酸对K562细胞增殖活性的影响 采用H3 -TdR掺入法.结果应用重复观察数据统计分析法进行分析. 1.5 CRKL基因表达的检测 采用RT-PCR法，并以β-actin为内［对照，收集各组处理72h后的K562细胞，采用Trizol试剂盒（购自Gibco公司）提取总RNA，引物由上海Sangon公司合成，β-actin引物为本校生化教研室柴玉波博士惠赠.引物序列［3］ 如下:CRKL基因5′端引物:5′-ACA GCA GAA GAT AAC CTG-3′;3′端引物:5′-CCC AAG CTT TTC TGG ATT GCT TTC GC-3′（扩增产物为355bp）;β-actin5′端引物5′-CCA CTG AAA AAG ATG AGT AT-3′;3′端引物:5′-CTT CAA CCT CCA TGA TGC TGC TG-3′（扩增产物为112bp）. 1.5.1 逆转录 （20μL体系）500mg L-1 的oligo（dT）12-18 3μL，10mmol L-1 的dNTP mix1μL，总RNA5μg，5×逆转录缓冲液4μL，0.1MDTT2μL，4×107 IU L-1 RNA酶抑制剂1μL，200IU的M-MLV（鼠源性逆转录酶）1μL，加DEPC-dd H2 O至20μL后置混合物于37℃水浴50min，最后于70℃灭活15min.（上述反应物均购自华美公司）. 1.5.2 PCR采用100μL反应体系 10×缓冲液（不含Mg2+ ）10μL，15mmol L-1 的MgCl2 10μL，2.5mmol L-1 dNTP2μL，cDNA2μL，taq酶1μL（5×106 IU