CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分化的影响论文.docVIP

　　CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分化的影响论文 陈珑，刘必成，马坤岭，刘宏，罗冬冬 目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的肾小管细胞转分化的可能影响。方法：采用体外培养的人近曲肾小管上皮细胞株（HK2），分别观察CTGF反义寡核苷酸和AngⅡ干预细胞对细胞CTGF mRNA和蛋白质的表达、细胞内超微结构及细胞α平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达的影响。结果:AngⅡ干预HK2细胞48h后，细胞CTGF mRNA和蛋白的表达显著增高（P＜0.01）；AngⅡ干预96h后，细胞超微结构显示出间质细胞样结构；这些作用都可被CTGF反义寡核苷酸显著抑制。AngⅡ可以呈时间依赖性地刺激HK2细胞表达αSMA.freelRNA and protein expression icroscopy respectively. The effect of CTGF AS on AngⅡinduced cellular ultrastructure issive electronic microscope (TEM). The expression of αsmooth action (αSMA) munocytochemistry. The control group bled oligonucleotide (SC).Results It RNA and protein (P＜0.01, respectively). If the cells ulated esenchymal features. And these effects could be partially attenuated by CTGF AS. AngⅡ significantly stimulated the expression of αSMA in a timedependent manner, arkedly attenuated by the treatment ent ight be involved in the AngⅡ induced tubular cell EMT. Key an proximal tubular cell;angiotensin Ⅱ; connective tissue gros（Cardiff, UK）惠赠。细胞用含10%新生牛血清的DMEM培养液培养，每日换液1次，2～3d传代1次。 1.2 主要试剂 低糖型DMEM培养基（GIBCO公司），新生牛血清 （杭州四季青生物工程材料研究所），AngⅡ (Sigma公司)，CTGF反义寡核苷酸、错义寡核苷酸（全硫代磷酸化，上海捷倍思基因技术有限公司合成）。CTGF反义寡核苷酸（CTGF AS）序列（按文献［3］选取）：5′TACTGGCGGCGGTCAT3′；错义寡核苷酸(SC)： 5′GGTCTAGCTTGCGGAC3′。TRIPURE RNA提取液（GIBCOL公司）。CTGF的PCR引物（按文献［4］选取），上游引物5′GAGGAAAACATTAAGAAGGGCAAA3′，下游引物5′CGGCACAGGTCTTGATGA3′,选取GAPDH为内参照。山羊抗人CTGF多克隆抗体（R D公司），FITC标记兔抗山羊IgG（北京中山生物技术有限公司），鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），超敏SP试剂盒、AEC显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。 1.3 实验分组 实验分4组：A组为正常对照组，B组为AngⅡ（10-7mol L-1）组，C组为AngⅡ（10-7 mol L-1）加CTGF AS（20μg ml-1）组，D组为AngⅡ（10-7 mol L-1）加SC（20μg ml-1）组。 1.4 研究方法 1.4.1 RTPCR 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤各组细胞后，加入TRIPURE RNA提取液，按说明书步骤提取总RNA。用紫外分光光度计测260、280nm吸光值，重复3次，计算A260nm/A280nm值。按RTPCR操作步骤操作，总反应体系为50μl。反应条件为： 94℃预变性5min； 94℃扩增1min，55℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；72℃ 延伸8min。取CTGF和GAPDH的PCR产物各5μl，1.7％的琼脂糖凝胶电泳，用ImageMaster VDS扫描分析仪扫描凝胶图谱。用Total Lab分析软件对PCR条带进行密度扫描分析，目的片段和GAPDH的比值作为实验数据。实验重复3次。 1.4.2 激光共聚焦显微镜 细胞行免疫荧光化学染色，一抗为山羊抗人CTGF多克隆抗体,1∶100；荧光二抗为FITC标记兔抗山羊IgG,1∶