Calphostin C抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附论文.docVIP

　　Calphostin C抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附论文 王中群 崔静 李丽华 赵卫星 赵琪 苏蔚 申虎 位冒冒 【摘要】 目的 探讨酶修饰的低密度脂蛋白(ELDL)诱导内皮单核细胞黏附的机制及Calphostin C的干预效果。方法 采用体外培养和直接计数法观察荷脂ECV304内皮细胞黏附能力的变化；PepTag○RAssay法定性内皮细胞胞膜蛋白激酶C(PKC)活性状态；RTPCR和1)和抑制性蛋白κBα(IκBα)表达的变化。结果 ELDL呈剂量依赖性增强内皮单核细胞间的黏附，其活化内皮促进黏附的理想剂量为20～40 μg/ml浓度。另外，ELDL还可显著活化内皮细胞胞膜PKC，下调IκBα的表达而增强ICAM1的表达。应用PKC特异性抑制剂Calphostin C干预后，荷载25 μg/ml ELDL 8 h的ECV304内皮细胞ICAM1表达下调而IκBα则反相上调，黏附能力也在Calphostin C达到100 nmol/L浓度时显著下调，细胞状态明显好转；且200～400 nmol/L Calphostin C基本可以逆转ELDL对内皮细胞的影响。结论 内皮细胞黏附能力的强效促进剂ELDL可能是通过PKC/NFκB/ICAM1发挥作用的，针对PKC靶酶的特异性抑制剂Calphostin C可以有效地抑制由ELDL引起的内皮活化黏附增强。 【关键词】 Calphostin C；低密度脂蛋白.freelol公司)。总RNA提取试剂盒TRIzol(购自上海Sangon公司)；ImPromIITM Reverse Transcriptase、PepTag○RNonRadioactive PKC Assay Kit 和BCATM Protein Assay Kit(购自Promega)；MasterMix一管便捷式PCR扩增试剂盒(购自北京天为时代)；所有引物(由上海生工生物工程服务有限公司合成)；IκBα和ICAM1一抗，SO孵育细胞8 h；②25 μg/ml ELDL+25 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；③25 μg/ml ELDL+50 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；④25 μg/ml ELDL+100 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；⑤25 μg/ml ELDL+200 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；⑥25 μg/ml ELDL+400 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h。加入处理因素后每组细胞均在距20 Reverse Transcriptase合成cDNA，再取逆转录产物10 μl进行PCR循环。ICAM1引物序列5′CAGTCACCTATGGCAACGAC3′(正义)，5′ATTCAGCGTCACCTTGGCTC3′(反义)，243 bp；βactin 引物序列 5′ATCCCTGTACGCCTCTGG3′(正义)，5′TCCTTCTGCATCCTGTCG3′(反义),.freelin预变性，95℃ 30 s变性，60℃ 30 s退火，72℃ 1 min延伸，35个循环，72℃ 5 min继续延伸。IκBα引物：5′CGTTCCTGCACTTGGCCATC3′(正义)，5′GTCCGGCCATTACAGGGCTC3′(反义)；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min,共32个循环，409 bp。反应结束后，取RTPCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，加样量均为10 μl，溴化乙锭染色。电泳条带采用UVP凝胶图像分析系统做积分吸光度测定和分析，以各组目的基因与内参照基因吸光度值的比值来比较待测基因mRNA的表达差异。 1.7 1的蛋白免疫印迹检测。蛋白条带采用UVP凝胶图像分析系统分析。以对照组的面积灰度值为100%，与实验组进行比较和半定量分析。 1.8 统计学处理 数据用x±s表示，组间比较采用方差分析及t检验，由SPSS11.0统计软件完成。 2 结 果 2.1 ELDL增强内皮单核细胞的黏附 倒置生物光学显微镜下可见未加处理因素的对照组内皮细胞呈胖梭形铺路石样外观，单核细胞小圆形、透亮，生长状态良好。用ELDL37℃孵育8 h后，ECV304内皮细胞黏附的单核细胞数目明显增加；细胞计数显示ELDL呈剂量依赖性的方式增强内皮单核细胞的黏附。由表1可见：随着ELDL浓度由0上升到20 μg/ml，内皮细胞的黏附能力也增加了2.5倍；但20 μg/ml ELDL处理组与40 μg/mlELDL处理组内皮细胞的黏附能力差异不显著(P＞0.05)，显示该