p38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达研究论文.docVIP

　　p38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达研究论文 【摘要】 目的：探讨慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样小鼠肾组织p38MAPK的表达变化,进而分析p38MAPK在狼疮肾炎肾纤维化发生中的作用。方法：将12只雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1杂交鼠随机分为模型组及正常对照组,每组6只。于16周末处死，取肾行HE和Masson染色，应用免疫组化方法检测TGF-β1、p38MAPK、P-p38MAPK在肾脏的定位表达，RT-PCR法研究各组肾组织TGF-β1、p38MAPK mRNA的表达,APK、P-p38MAPK蛋白的表达水平，并观察两组小鼠24h尿蛋白排泄量。结果：与正常对照组比较,模型组小鼠24h尿蛋白排泄量、TGF-β1、p38MAPK和 P-p38MAPK蛋白及mRNA表达均明显增加(P＜0.01),TGF-β1与p38MAPK的表达呈正相关(r=0.418,P＜0.05)。结论：cGVHD狼疮样小鼠肾组织中TGF-β1、p38MAPK和P-p38MAPK蛋白及mRNA表达明显上调,p38MAPK信号通路可能在狼疮肾炎肾纤维化的进程中起重要作用。 【关键词】 慢性移植物抗宿主病； 狼疮肾炎； p38MAPK； 小鼠 狼疮肾炎（lupus nephritis,LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus SLE）最重要的临床表现之一，其病理改变以肾小球、血管、肾小管及其间质损害为特征，最终急性或慢性进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭。肾脏纤维化不仅是各型LN进展到终末期的共同病理表现，而且也是患者病情的重要反映指标.freelitogen-activated protein kinase,MAPK) 级联是细胞内重要的信号转导系统,它参与胞外信号从表面转导到细胞内部的过程,为细胞内信息传递的共同通路。近年来许多研究结果表明，其亚族p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)作为信号转导通路的交汇点在肾脏纤维化的发生发展中起着重要作用，但在LN肾纤维化的发生过程中是否起作用尚未见报道。因此本研究通过构建慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus host disease,.freelmol·L-1)2μl,Oligo dT 1μl,dNTPs(10mmol·L-1)2μl,RNase inhibitor 0.25μl,AMV逆转录酶(TaKaRa公司)1μl,总RNA 2.75μl,30℃ 10min后42℃逆转录50 min,99℃灭活逆转录酶5 min,5℃ 5 min,所得cDNA保存于-20℃用于PCR扩增。 1.4.3 PCR扩增 TGF-β1、p38MAPK及GAPDH内参照引物用DNA Club软件设计,由上海英骏生物工程公司合成,序列如下:p38MAPK上游引物5′-tcgagaccgtttcagtccat-3′,下游引物5′-ccacggaccaaatatccact-3′,产物为463bp；TGF-β1上游引物5′-tgcttcagctccacagagaa-3′,下游引物5′-cttgcgacccacgtagtaga-3′,产物为267bp；GAPDH上游引物5′-acttgaagggtggagccaaa-3′,下游引物5′-ccaggaaatgagcttgaca-3′,产物为608bp。反应体系:5×PCR缓冲液10μl,MgCl2 4μl,dNTPs 1μl,上下游引物各1μl,cDNA模板1μl,TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)0.25μl,补足双蒸水至50μl。Eppendorf AG 22331 PCR扩增仪扩增,p38MAPK条件为:94℃预变性3min；94℃变性30s,54℃退火40s,72℃延伸1min,循环36次；72℃终末延伸10min。TGF-β1改退火温度为56℃，其余与p38MAPK相同。 1.4.4 产物检测 扩增产物在含0.5mmol·L-1溴乙锭的1%琼脂糖凝胶中以4～5V·cm-1电压降电泳30min。于Image Master VDS凝胶扫描仪上成像,用Totallab V 2.01凝胶图像分析软件进行半定量分析。所有TGF-β1、p38MAPK扩增产物的吸光度均以GAPDH为基准校正,以TGF-β1/GAPDH、p38MAPK/GAPDH表示。 1.5 病理检查 2μm连续切片,置多聚赖氨酸包被的载玻片上,分别作HE和Masson染色，在普通光镜下观察各组小鼠肾组织病理变化。 1.6 免疫组化检测 SABC法免疫组化染色(试剂盒购自晶美生物技术有限公司)：取2μm厚石蜡切片脱蜡至水；加3%过氧化氢溶液,室温下孵育10 min；滴加胃蛋白酶修复抗原,37 ℃孵育15 m