Ras┐MAPK信号转导系统在哮喘气道重塑中的作用论文.docVIP

　　Ras┐MAPK信号转导系统在哮喘气道重塑中的作用论文 宋立强 戚好文 郎兵 刘飞 【关键词】 ,.freelin间数个时间点，采用Dot-blot分子杂交法检测气道ras mRNA水平.免疫组化ABC法研究气道Ras和MAPK蛋白的表达情况. 结果 与正常对照组相比，哮喘组豚鼠气道上皮水肿、脱落，平滑肌层及基底膜显著增厚.诱喘后ras mRNA的表达水平明显上调，30min达高峰并维持至120min.各级气道的上皮和平滑肌细胞Ras表达量显著增加，而MAPK只在气道平滑肌层呈现高表达现象. 结论 Ras-MAPK信号转导系统在哮喘气道重塑早期发挥重要作用，阻断这一途径有望延缓重塑的病理过程. Keya;airodeling;signal transduction Abstract:AIM To investigate the role of Ras-MAPK signal transduction pathodeling of aira.METHODS The asthma models in guinea pigs.freelRNA in air-ined by Dot-blot molecular hybridization at several points after provokation（0，30，60，120，240min）.Immunohis-tochemical techniques al group，asthma animal aira and drop of epithelium cells，thickening of smooth muscle layer and base membrane.And the level of ras mRNA increased obviously，reaching the peak30min and maintaining to120min after the provocation.The expression of Ras and smooth muscle layers of airooth muscle cells.CONCLU┐SION Ras-MAPK signal transduction path-portant role in airodeling in asthma at early age，thus blocking the pathological process may be a potential treat-ment strategy. 0 引言 气道重塑（airodeling）是指哮喘患者气道中平滑肌和基底膜增厚的异质性改变.由此导致气流不可逆阻塞和持续的气道高反应性，现认为是顽固性哮喘的重要病理基础［1］ .我们的前期研究［2］ 结果表明，气道壁c-fos，c-myc，c-jun和c-sis等原癌基因表达增强是气道重塑的重要早期事件.那么，真核细胞中对生长和发育具有调节功能的Ras-MAPK信号转导系统，在重塑中是否介导基因的表达过程?目前尚不清楚.我们以豚鼠哮喘模型为对象，探讨Ras-MAPK途径激活情况与气道重塑的关系. 1 材料和方法 1.1 材料 抗pan-Ras及MAPK mAb分别购自武汉博士德、Sigma公司.含ras cDNA的质粒由第四军医大学生物化学和分子生物学教研室提供，Trizol购自Gibco公司，质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司，各种限制性内切酶购自宝灵曼公司. 1.2 方法 1.2.1 动物模型及标本制备 第四军医大学实验动物中心提供成年雄性豚鼠40只，体质量300～350g，随机平分为哮喘组和正常对照组.哮喘组用10g L-1 卵蛋白（OVA）和10g L-1 氢氧化铝混悬溶液0.5mL，ip，致敏，第8日重复注射1次;第15日始雾化吸入OVA激发动物哮喘发作，隔日1次，共10次.对照组以同样方法致敏，但吸入生理盐水而非OVA.分别在末次激发试验后即刻、30，60，120及240min处死相应动物.①提取总RNA:动物放血后，迅速剥离气管及主支气管，Trizol法提取总RNA;②制备发作后30min动物气道组织切片:40g L-1 多聚甲醛经右心室灌注并取气管和肺，200g L-1 蔗糖浸泡后，于-20℃下制备20μm冰冻切片. 1.2.2 Dot-blot杂交法检测气道ras mRNA的表达 将含ras cDNA的质粒转染DH5α感受态细菌，扩增制备质粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收cDNA片段，并α-32 P-dCTP随机引物法标记cDNA探针.将提取的总RNA移至尼龙膜上，预