rhBMP2m在高浓度条件下的复性论文.docVIP

　　rhBMP2m在高浓度条件下的复性论文 王馥丽,陈苏民,陈南春,赵玮钦 【摘要】 目的： 优化高浓度的人骨形成蛋白2成熟肽（rhBMP2m）的复性条件. 方法： 将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达，裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化. 纯化后的蛋白在不同的温度、复性液pH, 氧化交换系统浓度、盐浓度等条件下进行透析复性. 透析复性后进行非还原的SDSPAGE, 检测rhBMP2m活性形式二聚体的含量，同时找出相对较优的复性方法对复性产物进行0.22 μm微孔滤膜除菌并计算其损失率. 结果： 经透析复性后rhBMP2m完全可溶，而且其活性形式二聚体的含量达到30%左右，即复性后二聚体的rhBMP2m可以达到每升发酵液800 mg，并且经微孔滤膜除菌后rhBMP2m活性形式二聚体的含量基本没有损失，同时蛋白定量也表明过滤除菌后蛋白损失不超过10%. 结论： 高pH有利于rhBMP2m的复性，除变性剂尿素时采用低pH可以保持高浓度rhBMP2m复性后仍保持可溶. 蛋白质的浓度、pH和温度对蛋白复性的结果影响很大.freelorphogeic protein, BMP) 是转化生长因子β (transforming groan bone morphogeic protein2 mature peptide，rhBMP2m) 已经被商业化生产并应用在多种临床研究中，包括治疗骨质缺损、颌面修复等. 但由于利用哺乳动物细胞制备rhBMP2m，其表达水平很低，纯化过程复杂，使得产品价格高昂，制约着其推广应用［3］. 虽然从大肠杆菌制备BMP产量高、成本低，但由于BMP活性形式是由含有3对二硫键的成熟肽肽链再以二硫键连接而成的二聚体［4］，而且BMP含有两个伸展的非极性片段［5］，具有很强的疏水性容易沉淀，使BMP复性的难度很大，目前所报道的复性方法［6］，在线复性［7］等用于rhBMP者都还有待改进. 本研究探索和优化rhBMP2m的复性条件，试图提高复性的二聚体产量，以解决rhBMP2m疏水难溶、不能过滤除菌等难题. 1材料和方法 1.1材料菌种DH5α/pDH2rhBMP2m由本教研室构建并保存; BioFloⅣ型15 L全自动发酵罐（美国NBS公司）；SPSepharose FF, QSepharose FF（Pharmacia公司）；透析膜(截留分子质量10 000)（华美公司）；低温高速离心机（湘西仪器仪表厂）；超声细胞粉碎仪JY983（宁波新芝科仪研究所）；SDSPAGE垂直平板电泳系统（BIORED公司）；溶菌酶（Invitrogen）去氧胆酸钠（上海伯奥生物科技有限公司）；TritonX100（FARCO CHEMICAL）；DNAase I, SDS（SIGMA公司）；丙烯酰胺、NN亚甲基双丙烯酰胺、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、尿素、β巯基乙醇等均为分析纯国产试剂, （天津化学试剂六厂和沈阳化学试剂厂）；BCA蛋白定量试剂为本实验室配制；Loarker，标准蛋白（上海生物化学研究所）. 1.2方法 1.2.1DH5α/pDH2rhBMP2m高密度发酵采用恒溶氧高密度发酵方法［8］. 取-70℃保存的DH5α/pDH2rhBMP2m工程菌株甘油菌种，划LB琼脂平板，含100 μg/mL氨苄青霉素，32℃培养20 h. 挑单菌落接入6 mL LB培养基中，30℃摇床培养16 h. 转入300 mL LB，30℃摇床培养10 h. 转入15 L发酵罐，计算机自动控制搅拌、通气溶氧，30℃继续培养16 h. 发酵罐内42℃诱导表达4 h，结束发酵，6000 r/min 离心收菌. 1.2.2裂菌、包涵体纯化用裂解缓冲液(100 g/L蔗糖,.freelmol/L pH 8.0 TrisHCl，1 mmol/L EDTA)悬浮发酵所得到的菌体，置冰浴中，按3 mg/g湿菌加入溶菌酶裂菌，16 000 g离心后收得包涵体. 按每克湿沉淀加入3 mL包涵体洗涤液(5 g/L TritonX100，10 mmol/L pH 8.0 TrisHCl，1 mmol/L EDTA)悬浮包涵体，超声处理，1360 P2m① SPSepharose FF阳离子柱层析分离： 洗涤后的包涵体溶解于pH 6.5的SPbuffer(8 mol/L尿素，20 mmol/L pH 6.5磷酸钠缓冲液，0.014 mol/L β巯基乙醇)中，充分溶解后上SPSepharose FF阳离子柱，用适合浓度的NaCl溶液洗脱，收集蛋白峰，透析除去尿素β巯基乙醇，离心收集沉淀. ② QSepharose FF阴离子柱层析纯化： 将SPSepharose FF柱层析纯