RhoC-siRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞体外侵袭能力的影响.docVIP

　　RhoC?siRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞体外侵袭能力的影响 郑文建 梁平 赵弘智 韩克强 【摘要】 目的 构建RhoC?siRNA表达载体，研究其对肝癌细胞体外侵袭潜能的影响。方法 以脂质体转染法稳定转染人SK?Hep1肝癌细胞株，ethods RhoC?siRNA gene igration, and cell invasion before and after transfection e digestion and DNA sequencing confirmed that the RhoC specific siRNA expression vector igration, and cell invasion arkedly, etastasis, ay provide a novel applicable strategy for gene therapy of HCC. 【Key ors; Invasion; RhoC?siRNA Rho(ras homologous)基因亚家族成员(RhoA、B、C)是一类与ras同源的小GTP结合蛋白，Rho亚家族蛋白的异常表达可能与恶性肿瘤的侵袭、转移有关。有资料表明，RhoC基因产物的过量表达与肝癌发展及侵袭、转移有密切关系［1］。本研究通过构建RhoC特异性siRNA真核表达载体，并稳定转染到肝癌细胞株SK?Hep1中，以探讨抑制RhoC蛋白表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株、菌株及质粒：人肝癌细胞株SK?Hep1购自中科院上海细胞所，大肠杆菌DH5α感受态细胞由新桥医院中心实验室保存，质粒pSilencer 2.1为Ambion公司产品。 1.1.2 酶和试剂：新生牛血清购自PAA，RPMI 1640购自Hyclone，G418购自BPI，DOTAP购自Roche，羊抗人RhoC多克隆抗体购自Santa Cruz，HRP标记的兔抗羊二抗购自北京中杉公司，质粒小量抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自中鼎公司，T4 DNA Ligase、BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、λ?EcoT14 Ⅰ Marker购自TaKaRa。其他试剂均为分析纯。 1.1.3 模板DNA：插入双链寡核苷酸基因片段(BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense+终止信号+SalⅠ+HindⅢ)，A：5′?GATCCGGATCAGTTTCCGGAGGTCTTCAAGACGGACCTCCGGAAACTGATCCTTTTT?TGTCGACA?3′，B：3′?GCCTAGTCAAAGGCCTCCA?GAAGTTCTGCCTGGAGGCCTTTGACTAGGAAAAAA?CAGC?TGTTCGA?5′，由武汉晶赛生物公司合成。其编码的siRNA为AAGGATCAGTTTCCGGAGGTC，该序列经Blast查询与人类其他基因无同源性。 通用阴性对照质粒pSilencer 2.1?HK为武汉晶赛生物公司产品。其编码的siRNA为ACTACCGTTGTTATAGGTG，该序列经过Blast比较，与人、鼠基因库无明显同源。 1.2 方法 1.2.1 pSilencer 2.1真核表达载体的构建及鉴定：按基因克隆方法构建重组质粒pSilencer 2.1?RhoC?siRNA，经扩增并提取质粒后，用SalⅠ做酶切鉴定，并送上海英骏公司进行DNA全长自动测序。 1.2.2 重组体转染SK?Hep1细胞及转染后细胞中RhoC表达的检测：分别用pSilencer2.1?RhoC? siRNA和pSilencer 2.1?HK转染SK?Hep1细胞，48 h后稀释传代并在培养基中加入G418(300 μg/ml)筛选培养2周左右，将抗性细胞克隆转至培养瓶中培养并传代建系，分别命名为SK?Hep1/RhoC?siRNA和SK?Hep1/HK细胞。收集细胞，用RIPA液裂解， 离心取上清液行atrigel(1 mg/ml)的24孔板中常规培养：(1)1 h后按MTT比色法测各孔细胞的OD570值，并计算黏附率(黏附率=黏附细胞OD570值/总细胞OD570值×100%)； (2)细胞基本长满后划痕，以无血清培养液培养48 h后观察细胞向划痕区的迁移能力。 (责任编辑：) 1.2.4 细胞侵袭分析：Boyden小室法［2］。培养16 h后计数PET膜下表面5个400倍显微视野中的细胞数，以侵袭细胞的相对数目反映细胞的侵袭能力。每组平行设3个小室。 1.3 统计学分析 采用SPSS 10.0软件进行统计分析，对不同的数据资料分别采用t检验及χ2检验。 2 结果 2.1 pSilencer 2.1真核表达载体的构建与鉴定