PLA表位肽免疫微球诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤作用论文.docVIP

　　PLA表位肽免疫微球诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤作用论文 陈玮 蔡美英 曹伟民 魏大鹏 【摘要】 目的 考察载肽聚乳酸微球（PLA）体外诱导特异性CTL杀伤活性。方法 采用标准51Cr释放法检测CTL杀伤活性。结果 免疫微球M1、M2在体外均能刺激人PBMC增殖，形成大量可见克隆；CTL杀伤分析结果显示，免疫微球M1、M2诱导的效应细胞对荷肽T2细胞（T2+P）、HepG-2和Alexander的杀伤率均达75％以上，二者的杀伤活性没有明显差异（P＞0.05）。它们对表达hAFP的肝癌细胞HepG-2和Alexander的杀伤率均显著高于不表达hAFP的膀胱癌细胞BTT和未荷肽的T2细胞，差异明显（P＜0.001）。结论 免疫微球M1、M2均能在体外诱导产生特异性CTL，并对表达靶抗原的肿瘤细胞有较强杀伤作用。 【关键词】 聚乳酸微球；肝癌细胞；CTL表位；杀伤 Abstract：Objective To survey the cytotoxicity of the CTL induced in vitro by PLA microspheres containing CTL epitopes derived from hAFP.Methods The specific cytolysis for hepatocellular carcinoma cell ethod.Results Ticroparticles(M1、M2)containing CTL epitopes derived from hAFP induced HLA-A2+ PBMC from healthy volunteer to produce cell proliferation and form abundant visible clones;The cytolytic rate for hAFP+ tumor cells icroparticles have potent capability to induce specific CTL in vitro and kill hAFP+ tumor cells effectively. Key icrosphere；hepatocellular carcinoma cell；CTL epitopes；cytotoxicity 肝癌是严重威胁人类生命和健康的肝脏恶性肿瘤，临床治疗效果不理想［1］。长期以来，人们一直致力于肝癌免疫治疗的探索。目前.freelan alpha-fetoprotein, hAFP）表达，本研究以hAFP为靶抗原，采用可生物降解的有机高分子材料聚乳酸(polylactic acid, PLA)，制备PLA包封的CTL表位肽免疫微球，检测其体外诱导的特异性CTL对肝癌细胞的杀伤活性，为进一步研究其体内免疫效应和机制提供实验基础［3］。 1 材料与方法 1.1 材料和仪器 HLA-A2限制的CTL表位hAFP158－166、hAFP218－226由本室确定，表位肽由西安美联公司合成、纯化、鉴定；聚乳酸（PLA Mr 75 000～90 000），中国科学院成都有机化学研究所曹伟民教授提供；Na251CrO4，PerkinElmer，USA；RPMI-1640，GIBCO；新生小牛血清，兰州民海生物工程有限公司；淋巴分离液，上海试剂二厂；MTT，华美生物工程公司；18～25岁HLA-A2健康志愿者；肝癌细胞Alexander、HepG-2，膀胱癌细胞BTT，为本室冻存保种；T2细胞［4］由美国耶鲁大学医学院哈佛休斯医学研究所Peter Cressray，USA；高速离心机，Beckman；UV-120紫外分光光度计，日本岛津；真空干燥机，浙江黄岩机械厂；γ计数器，国营二六二厂；DG-3022酶标仪，国营华光电子管厂。 1.2 方法 1.2.1 表位肽hAFP158－166和hAFP218－226的合成与纯化鉴定 表位肽委托西安美联公司采用固相合成法合成，合成所得粗产品经反相高效液相色谱纯化，冷冻干燥即得多肽纯品，并取样进行纯度分析和质谱鉴定。 1.2.2 荷肽PLA免疫微球的制备 采用溶剂挥发法制备微球。表位肽hAFP158－166与hAFP218－226的包封方法相同。称取80mg PLA溶解于10ml 二氯乙烷，加入0.2ml表位肽溶液（1mg/ml）,匀质器搅拌数秒，形成乳白色初乳，然后逐滴加入磁力搅拌下的20ml 5％PVA溶液之中。6min后，再加入40ml蒸馏水，继续搅拌，8h后离心洗涤3次，蒸馏水悬浮，测粒径。然后离心收集微球，部分做扫描电镜分析，其余冷冻干燥，辐照灭菌备用（四川省农科院生物核技术研究所进行）。 1.2.3 PLA免疫微球体外