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　　Nogo论文 武肖娜，李容，李静雯，鞠躬 【关键词】 细胞分化 Effects of NogoC on differentiation and neurite extension of PC12 cells 【Abstract】 AIM: To study the effects of NogoC on the differentiation and neurite extension of PC12 cells. METHODS: The expression of NogoC in NGFtreated PC12 cells munofluorescence. And pEGFPN1NogoC, the GFPtagged NogoC vector all amount of NogoC mRNA could be detected in NGFtreated PC12 cells; NogoC munofluorescence; the neurite extension of NGFtreated PC12 cells transfected RNA分子表达；② 免疫荧光染色观察到NGF诱导的PC12细胞中有少量NogoC的表达；③ 细胞计数观察到转染NogoC后的PC12细胞在NGF诱导后突起增长百分数相对于EGFP组明显增高. 结论： NGF诱导的PC12细胞中有NogoC的表达，同时过表达NogoC可促进NGF诱导下的PC12细胞的分化以及影响细胞的突起生长. 【关键词】 过表达；NogoC；PC12 细胞；细胞分化 0引言 Nogo分子是影响成年哺乳动物中枢神经再生最重要的抑制因子之一［1-2］.freelRNA，但RTPCR并没有检测到PC12细胞中有NogoC mRNA的表达. 用Northern Blot可以检测到NGF诱导后的PC12细胞中有少量NogoC mRNA表达［5］. 这些研究均提示NogoC与神经元的分化相关. 我们以PC12细胞为神经元模型，研究NogoC在神经元细胞的分化及突起生长中的作用. 1材料和方法 1.1材料 大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞系购自中国科学院上海细胞生物研究所. 绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pEGFPN1购自Clontech公司；编码人NogoC的cDNA 克隆进pEGFPN1构建成pEGFPN1NogoC［4］. Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)、胎牛血清、马血清、 OPTIMEM、脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000、TRIZAL等购自Gibco/Invitrogen 公司. 胰酶、NGF、购自Sigma公司. BcaBestTM RNA PCR Kit Ver 1.1试剂盒和DNA marker购自TAKARA公司. RabbitantiRat/Human NogoC多克隆抗体购自Chemicon公司. 荧光二抗Texas Red donkey antirabbit IgG购自Molecular Probes公司. PCR引物由生工生物工程技术服务有限公司合成，新生1 d SD大鼠仔鼠由第四军医大学实验动物中心提供. 1.2方法 1.2.1细胞培养PC12细胞使用DMEM培养基(添加50 mL/L 的胎牛血清和100 mL/L 的热灭活马血清)，置于37℃, 50 mL/L CO2的培养箱中培养，每隔48 h传代1次. 使用100 μg/L NGF的低血清DMEM培养基（含10 mL/L 的胎牛血清）对PC12细胞进行诱导分化3 d. 1.2.2转染及其诱导收获处于对数生长中期的PC12细胞进行接种，24 h后使用LipofectamineTM 2000转染质粒pEGFPN1及pEGFPN1NogoC，4 h后换完全培养液；需要进行诱导分化的细胞，在4 h后换100 μg/L NGF的低血清DMEM培养基，培养3 d后用于后续实验. 1.2.3RNA的提取和纯化及RTPCR使用TRIZOL试剂分别抽提正常PC12细胞、NGF诱导的PC12细胞以及作为阳性对照的新生1 d的SD大鼠仔鼠大脑皮层的RNA. 调整RNA浓度至25 mg/L，进行RTPCR. 大鼠NogoC的PCR引物［6］: 上游引物为5′GAAATGGACGGACAGAAGAAAC 3′，下游引物为5′CACATCAACACTGCAAACTTCA3′，扩增401 bp的片段. 大脑皮层PCR反应条件为: 96℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个循环. 细胞的PCR反应条件为: 96℃ 30 s, 56℃ 1 min, 72℃ 1 min, 35个循环. PCR产物使用10