NT4p53(C22)Ant重组腺伴病毒对人Miapaca论文.docVIP

　　NT4p53(C22)Ant重组腺伴病毒对人Miapaca论文 【关键词】 NT4p53(C22)Ant；重组腺伴病毒；胰腺肿瘤；细胞系 Killing effects of rebinant AAV expressing fusion peptide NT4p53(C22)Ant on human pancreatic cancer MiapacaⅡcells 【Abstract】 AIM: To study the killing effects of rebinant adenoassociated virus(AAV) expressing fusion peptide NT4p53(C22)Ant on human pancreatic cancer MiapacaⅡ cells. METHODS: NT4p53(C22)Ant plified in 293 packaging cells. The rebinant plasmid AAVNT4p53(C22)Ant an pancreatic cancer cell line MiapacaⅡ icroscope, MTT, floetry and lactate dehydrogenase(LDH) release assay. RESULTS: It could be observed under microscope that the AAVNT4p53(C22)Ant could directly kill the MiapacaⅡcells. MTT revealed that the survival rate of the cells etry shober of apoptotic cells ple AAV group (P 0.05). LDH level an pancreatic cancer MiapacaⅡcells to kill the cells directly. 【Keys; cell line 【摘要】 目的： 研究NT4p53(C22)Ant重组腺伴病毒对人MiapacaⅡ胰腺癌细胞杀伤作用. 方法： 构建NT4p53(C22)Ant，将其亚克隆于腺伴病毒载体中，经293细胞包装、扩增构成具有感染性的重组腺伴病毒AAVNT4p53(C22)Ant，转染人胰腺癌MiapacaⅡ细胞，经光镜下观察、MTT比色试验、PI染色实验及乳酸脱氢酶释放检测(LDH)，观察AAVNT4p53(C22)Ant对细胞的杀伤作用. 结果： 光镜下可见随AAVNT4p53(C22)Ant感染MiapacaⅡ细胞时间延长，肿瘤细胞数目明显减少；MTT实验检测发现细胞存活率明显降低(P 0.05)；流式细胞检测凋亡细胞数目较对照组及空病毒组增加(P 0.05)；LDH检测培养基中LDH只有轻度增加(P 0.05). 结论： 重组腺伴病毒NT4p53(C22)Ant对胰腺癌细胞有杀伤作用，并且是通过引起细胞凋亡而实现的. 【关键词】 NT4p53(C22)Ant；重组腺伴病毒；胰腺肿瘤；细胞系 0引言 胰腺癌的发生发展与多种基因异常有关.freelega公司；pBV220NT4质粒、腺伴病毒载体pSSHGCMV由西安华广生物工程有限公司提供；293细胞(人胚肾细胞)美国ATCC公司产品，西安华广生物公司复苏传代；RPMI1640培养基购自华美生物工程公司；MiapacaⅡ细胞株由吕毅教授馈赠；DMEM购自美国Gibco公司；MTT试剂购自华美生物工程公司；PI试剂购自Sigma公司；LDH试剂盒购自宝灵曼公司. 1.2方法 1.2.1构建AAVNT4p53(C22)Ant① 采用非对称引物/模板法，根据GenBank提供的人p53 361382位氨基酸cDNA序列及果蝇同源框序列4358位氨基酸的cDNA，设计正、负向引物/模板链，PCR扩增目的基因片段，回收的目的基因片段连接于pGEMTeasy载体，质粒转化细菌，阳性克隆筛选、酶切鉴定、序列测定正确后，大量制备酶切回收p53(C22)Ant片段；② 连接于pBV220NT4质粒，转化细菌，阳性克隆筛选、酶切鉴定、序列测定分析正确后，大量制备重组质粒pBV220/NT4p53(C22)Ant，回收NT4p53(C22)Ant目的cDNA片段；③ 亚克隆于腺伴病毒载体中，经293细胞包装、扩增、纯化及滴度测定构成具有感染性的重组腺伴病毒AAVNT4p53(C22)Ant. 1.2.2重组腺伴病毒感染MiapacaⅡ细胞① 复苏MiapacaⅡ(p53变异)细胞株，挑选50%融合的细胞10瓶，每瓶细胞数约为10×105个，100 mL细胞瓶面积为30 cm2；② 分别以AAVNT