ULBP4原核表达、 生物学功能鉴定及其单克隆抗体的制备和初步鉴定论文.docVIP

　　ULBP4原核表达、 生物学功能鉴定及其单克隆抗体的制备和初步鉴定论文 .freeliTMB(DE3) and mAb preparation Abstract AIM: To express human ULBP4 in RosettagamiTMB(DE3) and to prepare monoclonal antibody against ULBP4 for the research of γδT cells recognition mechanism. METHODS: DNA fragments of ULBP4 HO8910 RNA by reversetranscriptase polymerase chain reaction(RTPCR). The fragments encoding the former 225 amino acids of ULBP4 anufactory’s protocol and renatured in bag filter. It’s functional effect on NK cells ents. Prokaryotic expressed human ULBP4 onoclonal antibodies by means of the B lymphocyte hybridoma technique. RESULTS: ULBP4 rebinant protein can stimulate NK cells to secrete IFNγ. Through PEG fusion and screening by limited dilution, a cells secreting antiULBP4 antibodies. CONCLUSION: The fusion protein e time, the antiULBP4 mAbs provide a platform for further research. KeyiTMB(DE3) E.coli; Expression; Biological function; monoclonal antibody ［摘 要］ 目的: 在大肠杆菌中表达ULBP4重组蛋白, 并制备其特异性的单克隆抗体（mAb）, 为γδT细胞对ULBP4的识别机制研究奠定基础。方法: 根据GenBank中ULBP4的基因序列设计相应的引物, 用RTPCR方法从HO8910细胞中扩增得到ULBP4片段, 构建重组原核表达质粒pET22b(+)/ULBP4(前225aa胞外段), 在RosettagamiTMB(DE3)大肠杆菌中获得表达且主要位于包含体中, 经纯化透析复性后, 分析其对NK细胞IFNγ细胞因子分泌的影响。以ULBP4为抗原,.freelAb的杂交瘤细胞株。结果: 构建了pET22b(+)/ULBP4(225aa)原核表达体系, 并检测到重组蛋白的有效表达; 纯化的重组蛋白在体外培养体系中可以刺激NK细胞IFNγ细胞因子的分泌。此外, 还获得了4株可稳定分泌抗人ULBP4 mAb的杂交瘤细胞株。结论: 成功地构建并表达了具有生物活性的ULBP4, 为γδT细胞的识别机制研究建立抗原制备平台, 同时所制备的抗人ULBP4 mAb, 为后续研究奠定了基础。 ［关键词］ULBP4; NKG2D; IFNγ; RosettagamiTMB(DE3)大肠杆菌; 表达; 生物学功能; 单克隆抗体 NKG2D是一种激活性的C型凝集素受体, 由同源二聚体构成, 表达于多种淋巴细胞的表面。近几年, 发现了一种新的NKG2D的配体家族UL16 binding proteins（ULBPs又称为RAET1分子）1, 2, 其中, ULBP13为糖基磷脂酰肌醇连接的膜蛋白, 而ULBP4和RAET1G则为含跨膜区域和胞内区域的膜蛋白。它们在正常组织细胞表面不表达或表达量很低, 但病毒感染和细胞恶性转化后能明显增强其表达, 暗示了它们在抗感染免疫和肿瘤免疫中潜在的作用。序列分析提示其与MICA较为相似, 且都属于延伸的MHCI类分子家族, 但只含α1和α2功能域且不能呈递小肽。鉴于其序列上与MICA的相似性, 提示其可能也为γδ1T细胞群的抗原之一3。事实上, 已有证据表明其中的一个分子ULBP3可以被慢性B型淋巴细胞性白血病患者外周血的γδ1T细胞群所识别4。为了进一步加深对γδT细胞识别机制的认识, 我们在原核表达系统中表达并纯化了ULBPs家族的另外一个成员ULBP4, 同时制备其单克隆抗体（mAb）, 为今后的研究工作奠定实验基础。 1 材料和方法 1.1 材料 克隆载体pGEMT Easy Vector Syst