第十七章基因工.ppt

基因工程 Genetic Engineering 1928年Griffith的肺炎球菌转化实验 1944年Avery重做此实验并加以改进 DNA作为遗传物质的第一个实验证据 Avery和他的合作者：用降解DNA、RNA和蛋白质的酶分别作用于有毒的S 型细胞抽提物，然后分别与无毒的R型细胞混合，观察转化现象发生。 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系 在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为DNA克隆或分子克隆。 关于克隆人 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （三）目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （一）目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 聚合酶链式反应(PCR)是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。 该反应是一指数式反应，其可在短时间内使目的片段的扩增量达到106倍，可从极微量的DNA乃至单细胞含有的DNA起始，扩增出ug级的PCR产物。 生物学领域几乎无处不用 基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 DNA序列测定 基因定点突变 基因型（突变）检测， SNP分析，遗传背景分析 生物物种鉴定，系统进化研究 基因表达量研究（real-time PCR） / 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE） 核酸的研究方法 核酸制备的原则 防止核酸的降解和变性 采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用。 (一) DNA的分离 （二）RNA的分离 制备RNA三点注意事项： ①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性。 ②在破碎细胞的同时加入强变性剂(如胍盐)使RNase失活。 ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂(如RNasin)。 常用的制备RNA方法 用异硫氰酸胍／苯酚／氯仿抽提。（少量） （三）核酸含量的测定法 1.紫外分光光度法（260nm 2.定磷法 先用浓硫酸或过氯酸将有机磷水解成无机磷。在酸性条件下正磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝（660nm），通过测定磷含量计算出核酸含量。 当RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与甲基苯二酚(地衣酚)反应呈鲜绿色（670nm) DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595 nm处 二、核酸的超速离心 可以测定核酸的沉降常数和分子量 三、核酸的凝胶电泳 凝胶染色 琼脂糖凝胶电泳的应用 可以确定是否存在核酸物质。 可以近似测定DNA片段的分子大小和含量 凝胶上的样品可以回收，以供进一步研究 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 可用于分析相对分子质量小于1000 bp的DNA片段的电泳。 比琼脂糖凝胶的分辨率高 聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，用于RNA的分析不会分解样品 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1977年Sanger又提出了 “终止法” 共分4组，每组按一定比例加入一种2’，3’双脱氧核苷三磷酸；能随机掺入合成的DNA链，一旦掺入DNA合成即终止 ；经变性胶电泳，可从自显影图谱上直接读出DNA序列。现在测序仪采用此法。 (二)DNA的化学法测序 化学法测序由Maxam和Gilbert于1977年所发明。 基本原理：用特异的化学试剂作用于DNA分子中不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，就可以使末端标记的DNA