丁酸钠诱导结肠癌Lovo细胞凋亡及其对p53靶基因的调控论文.docVIP

　　丁酸钠诱导结肠癌Lovo细胞凋亡及其对p53靶基因的调控论文 【摘要】 目的 观察丁酸钠对结肠癌Lovo细胞p53的三个重要靶基因 ，p21mol/L丁酸钠进行干预。用MTT法检测细胞增生，流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期； AnnexinVFITC/PI 双标记观察细胞凋亡；RTPCR和期。p21RNA和蛋白的表达增加，其中以Gadd45的表达变化最明显。结论 2.5 mmol/L以上浓度的丁酸钠以剂量和时间依赖的方式，抑制结肠癌Lovo细胞增生，诱导凋亡；丁酸钠参与结肠癌Lovo细胞周期的调控.freelmol/L以上浓度的丁酸钠可以引起Lovo细胞的G2/M期阻滞；丁酸钠的上述作用可能与其调控Lovo细胞中p21 butyrate on the three main target genes of p53 ,including p21olecule mechanism of its inhibiting proliferation and inducing apoptosis of Lovo colon cancer cells.Methods The colon cancer cell line Lovo mol/L，2.5 mmol/L，5.0 mmol/L，10 mmol/L respectively. MTT ined by both floetry and Annexin VFITC/PI double tagging. RTPCR and aybe the effect associated butyrate, cell apoptosis ,.freela公司产品）：用0.1 M PBS配制成0.4 mol/L的储存液（pH=7.2），冰盒保存备用。AnnexinVFITC凋亡检测试剂盒（BioVision公司产品），引物由上海博亚生物公司合成。P21l,加到96孔板内，每孔加入200 μl。培养24 h后，实验组分别加入1.25、2.5、5.0、10 mmol/L丁酸钠，对照组分别加入等量PBS。每个浓度每个时间接种8个复孔。经丁酸钠处理12、24、48、72 h后，每孔加入MTT 20 μl，继续培养4 h后，弃上清，每孔加入二甲基亚砜150 μl，振荡10 min后，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值，绘制细胞生长曲线。 1.3 流式细胞仪分析细胞周期和凋亡 收集不同浓度丁酸钠作用0、24、48和72 h的Lovo细胞。调整细胞密度为1×106个/ml,加入碘化丙啶染色液，室温避光染色30 min，FACS Vantage流式细胞仪检测各组细胞DNA含量的变化。应用计算机细胞周期分析软件计算出各时相分布的百分比。 1.4 Annexin ⅤFITC/PI检测凋亡 离心收集5×105个细胞后，悬浮于500 μl的结合缓冲液中，加入5 μl的Annexin VFITC和5 μl的PI，室温避光孵育5 min，流式细胞仪分析。 1.5 RTPCR检测 p21RNA的表达 按照产品说明书，分别提取经 5 mmol/L丁酸钠作用0、24和48 h的Lovo细胞的总RNA，取5 μg RNA进行逆转录反应合成cDNA。以βactin为内参照，分别取3 μl模版进行PCR反应。 p21mol/L丁酸钠作用0、24和48 h的Lovo细胞的蛋白，取50 μg蛋白上样，电泳40～60 min，30 mA电流转膜4 h后，5%的脱脂牛奶封闭3～4 h，加一抗，4℃过夜，洗膜后加二抗，室温孵育1 h，DAB显色。 1.8 统计学分析 采用SPSS11.0软件对数据进行t检验分析，以P＜0.05判定为有统计学差异。 2 结果 2.1 细胞形态学观察 正常培养的Lovo细胞大多呈星状生长，表面有细长足突，细胞核大而亮，贴壁生长，见图1。丁酸钠作用后，细胞表面细长的足突回缩，细胞变成圆球状。随着丁酸钠浓度升高和作用时间延长，细胞逐渐脱壁、漂浮。图2为5 mmol/L丁酸钠作用48 h后的Lovo 细胞。10 mmol/L 丁酸钠作用48 h后，细胞脱壁、漂浮。 2.2 丁酸钠对Lovo细胞生长曲线的影响 2.5、5和10 mmol/L丁酸钠组，在加药后12、24、48和72 h观察均显示出明显的生长抑制作用，与对照组比较，差异有显著性(P＜0.01）（图3）。 2.3 丁酸钠对Lovo细胞周期分布的影响 随着丁酸钠浓度的升高，处于G2/M期的Lovo细胞比例逐渐增多，与对照组比较有显著性差异（P＜0.001），两两比较亦有显著性差异（表1）。表1 不同浓度丁酸钠作用48 h后Lovo细胞周期的分布 #▲P＜0.001；△#P＜0.001；▲P＜0.001 2.4 流式细胞仪检测Sub