交联型丙烯酸酯聚合物分子层用于固定寡核苷酸分子初探论文.docVIP

　　交联型丙烯酸酯聚合物分子层用于固定寡核苷酸分子初探论文 吴清华，马文丽，朱利娜，张宝 【摘要】 目的 探讨在显微玻片上衍生聚合物分子层用于固定寡核苷酸分子的方法，为基因芯片制备和应用提供技术支持。方法 利用交联聚合反应，在显微玻片表面衍生丙烯酸酯共聚物分子层，结合基因芯片技术制备寡核苷酸芯片。利用荧光标记的样品和CMT芯片杂交系统对所制备的芯片进行杂交实验，检测寡核苷酸在芯片表面的固定性能.freelicroarray fabrication is immobilizing DNA or oligonucleotide efficiently on modified surface. Methods The glass slides odified ide copolymer and EDC/NHS by covalent linkage method. Results A covalent immobilization of unmodified oligonucleotide on the glass surface icroarray fabrication. Hybridization experiments odified surfaces have high fluorescence intensity, loodified slide. The uniform, steady and regular shaped signal spots of the microarrays indicated that the prepared surfaces mobilizing unmodified oligonucleotides. Conclusion The process of the surface preparation is simple and cost effective and can be used for attachment of protein, PNA et cetra. Keymobilization; DNA microarray; acrylic acidcoacrylamide copolymer; covalent linkage 核酸分子的固定是生物分子固定化技术中重要的组成部分，该技术在核酸化学、分子遗传学及生物工程的研究中有着不可代替的作用。在近年发展起来的以特定核酸片段杂交检测技术为基础的基因芯片或生物传感器技术中，生物分子的固定尤其是核酸分子在载体表面的固定是这些技术在药物分析、基因表达和功能基因组研究、DNA测序、医学诊断等应用中的基础［14］。如何在平整致密的表面快速稳定地固定核酸分子是芯片制备首先要解决的问题。为了克服目前核酸特别是短片段寡核苷酸在玻片上固定率低和稳定性差的缺点，解决其在基因芯片制备和应用中需突破的化学上游技术问题，本实验采用丙烯酸、丙烯酰胺这两种常见的有机聚合物单体，利用共聚反应在氨丙基三甲氧基硅烷硅化后的玻璃表面上进行交联聚合，制备能共价结合(固定)寡核苷酸分子的表面，并打印寡核苷酸探针，最后对寡核苷酸芯片进行杂交检测与分析。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 氨丙基三甲氧基硅烷（APS）、碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）等购自美国Fluka公司；丙烯酸、丙烯酰胺、过硫酸胺、NaOH、HCl等购自汕头试剂厂（分析纯）；国产光学显微载玻片。CMT芯片杂交盒（美国Corning公司）；Pixsys5500基因芯片点样仪（美国Cartesin公司）；ScanArray Lite基因芯片扫描仪（美国Parkard公司）；GS Gene Linker紫外交联仪（美国BIORAD公司）。 1.2 丙烯酸酯聚合物表面的制备方法 显微玻片的清洗与硅烷化按文献［5］所述方法进行，其中硅烷化溶液为10%的APS溶于90%的甲醇溶液。将100片经APS硅烷化的玻片浸入1∶1包被液和活化液的混合液中3 h，反应时不断摇晃，随后用的ddH2O清洗玻片3次，玻片放入离心机中500 r/min离心5 min，烘干，暗盒保存备用。包被液的配制：0.8%丙烯酸和0.2%丙烯酰胺溶于ddH2O中，70 ℃加热，加热过程中缓慢加入0.8%过硫酸胺作催化剂。包被液可以在4 ℃保存备用。活化液的配制：0.1 mol/L碳二亚胺和20 mmol/L N羟基琥珀亚胺酯溶于0.1 mol/L pH为6.0的K2HPO4和KH2PO4的缓冲液中。 1.3 寡核苷酸探针的合成与纯化 本实验中寡核苷酸探针序列见表1，寡核苷酸的合成与纯化按照文献［6］的方法制备。表1 寡核苷酸探针序列 1.4 寡核