人外周血单核细胞B7.2基因的克隆及其可溶剪接体的发现论文.docVIP

　　人外周血单核细胞B7.2基因的克隆及其可溶剪接体的发现论文 蔡荣钦，沈娟，林克波，邵红伟，黄树林 【摘要】 目的 研究B7.2基因在肿瘤免疫方面作用，从人外周血单核细胞中克隆人B7.2基因的全长基因，并构建含此基因的重组质粒。方法 根据人B7.2基因序列设计特异引物，用RT-PCR、巢式PCR方法扩增B7.2基因的全长基因.freelily members include B7.1 and B7.2,portant costimulatory molecules in immune system. So an B7.2 gene from PBMC (peripheral blood mononuclear cell). Methods lt ers of human B7.2 gene and gained its full-length CDS by RT-PCR and nested PCR,then ligated the objective fragment into pGEM-T vector and transformed into E. coli for screening. The positive clones id successfully and discovered a neembrane region in the integrated B7.2 protein.Conclusion The clone of human B7.2 gene lays solid base for the investigation of the structure and function of B7.2 protein and its biological effect in tumor immunology. Hopact of this nei1y) V和C结构域的胞外区，含有8个潜在的N-糖基化位点，23个氨基酸残基构成疏水性跨膜区和60个氨基酸构成胞浆内区［5］。 本研究通过从人外周血单核细胞中克隆人B7.2编码区全长基因，得到一个新的差异剪接体，为进一步研究B7.2所编码的蛋白质结构和生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 主要材料 人新鲜血液由广州市血液中心提供，大肠杆菌DH5α均由本实验室保存，M-MLV反转录试剂盒，pGEM-T试剂盒购自Promega公司，Taq plus酶、 Trizol购自Fermentas公司，人淋巴细胞分离液为TD science产品，凝胶纯化试剂盒为V-gene公司产品，上、下游引物由Invitrogen公司合成。 1.2 方法 1.2.1 引物设计 根据GeneBank人B7.2 cDNA序列设计引物。外上引物B72t1：5′-TATTAGGTCACAGCAGAAGC-3′；外下引物B72t2：5′-GAATACTTGTATGGGCTTAC-3′；内上引物B72e1：5′-GCCTCTAGAGCCACCAATGG ATCCCCAGTGCACTAT-3′；其中斜体表示XbaI酶切位点，划线部分序列为Kozak序列；内下引物B72e2：5′-TTAGGTACCTTAAAA ACATGTATCACTTTTGT-3′，其中斜体表示KpnI酶切位点（扩增长度为972 bp）。引物合成由上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen）完成。 1.2.2 总RNA提取 先用淋巴细胞分离液按说明从人外周血中分离淋巴细胞，细胞计数后，在1.5 mL DEPC处理后EP管中加入1 mL Trizol液,从1×107个淋巴细胞中提取总RNA。120 V电压0.8%的琼脂糖电泳鉴定。在260/280 nm下测定RNA的纯度和含量。RNA置-70 ℃ 下备用。 1.2.3 反转录成cDNA 取1 μg 淋巴细胞的RNA进行反转录，方法参照产品说明书。 1.2.4 巢式PCR扩增人B7.2基因全长cDNA 扩增体系：模板1 μL、5 μmol/L引物各2 μL、1UTaq酶、buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTP 0.5 μL、用ddH20补足至25 μL。循环参数：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。得到第一次PCR产物后，再以B72 e1、B72 e2为引物，第一次PCR产物分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍、1 000倍为模板进行第二轮扩增［6］，反应体系及循环参数同上。 1.2.5 克隆载体pGEM-B7.2的构建 扩增产物经胶回收纯化后，与pGEM-T载体按推荐体系，