人核心蛋白聚糖的克隆及其在大肠杆菌中的表达论文.docVIP

　　人核心蛋白聚糖的克隆及其在大肠杆菌中的表达论文 王利民 温铭杰 李慎涛 【摘要】 目的 在大肠杆菌中高效表达人核心蛋白聚糖，并建立适当的纯化方法，制备重组蛋白。方法 根据GenBank中人核心蛋白聚糖的序列设计特异性引物，从人肝cDNA文库中PCR扩增核心蛋白聚糖的编码序列，克隆到原核表达载体pET42a中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，获得以高效表达的目的重组蛋白；用SDSPAGE和质谱鉴定重组蛋白。结果 重组蛋白主要以包涵体形式表达.freelan decorin in Escherichia coli effectively, to set up a appropriate protocol for purification of the rebinant protein and to prepare the expressed human decorin.Methods Specific primers for human decorin an decorin plified from a human liver cDNA library, and id of DpET42a. The plasmid ed into BL21(DE3) strain of E. coli.After induction an decorin an decorin of inclusion body. Identifications by SDSPAGE and mass spectrometry demonstrated that the rebinant protein an decorin.Conclusion Human decorin an decorin. 【Key ass spectrometer 在传统的烧伤治疗中，深度烧伤不可避免形成病理性瘢痕，由于病理性瘢痕形成机制尚未完全明确，烧伤后增生瘢痕及瘢痕疙瘩成为目前困扰临床治疗日益突出的问题。随着细胞生物学及分子生物学在瘢痕形成机制方面研究的深入，人们发现多种生长因子在瘢痕的形成中起作用，目前研究较多的有转化生长因子β(TGFβ)、表皮生长因子(EGF)、血小板生长因子(PDGF)及碱性生长因子(bFGF)，其中TGFβ的作用尤为突出，TGFβ是一种具有多种生物学效应的细胞因子，在损伤修复过程中可诱导纤维黏连蛋白、肌腱蛋白、胶原及蛋白多糖等多种细胞外基质（ECM）的沉积，同时通过降低蛋白酶的合成及提高蛋白酶抑制剂的水平阻止ECM的降解，诱导ECM的沉积，导致瘢痕的形成［1］。 体外及动物实验均已证实TGFβ抑制剂——核心蛋白聚糖（Decorin）能与TGFβ结合，中和其活性，从而可以治疗烧伤瘢痕。国内外对治疗用Decorin的研究已做了大量的工作，但仍有许多空白，到目前为止，国内尚未见重组人Decorin的报道。本研究将人Decorin基因在大肠杆菌中高效表达，为生产治疗用Decorin打下基础。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌种及质粒：人肝cDNA文库，E.coli DH5α、BL21（DE3）及pET42a(+)质粒为本室保存。 1.1.2 主要试剂及仪器：VentRDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶（BioLabs公司）；质粒小提、玻璃奶回收试剂盒（博大泰克公司、赛百胜公司）；DNA相对分子质量标准（TaKaRa公司）；其它试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 目的基因的扩增：根据GenBank中人Decorin的基因序列，设计合成一对引物（上海生工生物 通讯李慎涛，Email:lishentaosina.工程技术服务有限公司合成），引物中引入NdeⅠ、HindⅢ酶切位点。扩增编码Decorin的DNA序列。 P1：5GGAATTCCATATGAAGGCCACTATCATCC3，P2：5CCCAAGCTTTTACTTATAGTTTCCGAGTT3，以人肝cDNA文库为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增Decorin全长基因。扩增参数为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，32个循环；72℃后延伸10 min。电泳观察结果。 1.2.3 目的基因表达质粒（pET42/D）的构建：将特异的PCR扩增产物经玻璃奶回收纯化。纯化产物与原核表达质粒pET42a(+)分别用NdeⅠ、HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收。经T4DNA连接酶连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB培养板上，37℃培养过夜。挑取单克隆扩增后提取重组质粒进行NdeⅠ、HindⅢ双酶切及PCR电