人截短型凋亡诱导因子对HeLa细胞的促凋亡作用论文.docVIP

　　人截短型凋亡诱导因子对HeLa细胞的促凋亡作用论文 张巍，张勇，孟艳玲，温伟红，薛茜，任君琳，杨安钢 【关键词】 凋亡诱导因子；,HeLa细胞；,细胞凋亡 Proapoptotic activity of truncated human apoptosisinducing factor on HeLa cells 【Abstract】 AIM: To observe the expression of truncated human apoptosisinducing factor (AIF) gene and its effect on HeLa cells. METHODS: After AIF△1-120 gene an AIF gene (AIF△1-400) inal mitochondrial localization sequence(MLS), the coding sequence of flavine adenine dinucleotide (FAD) binding domain and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) binding domain of AIF protein．The truncated human AIF gene (AIF△1-400) icroscope analysis and MTT test． RESULTS: The eukaryotic expression vector containing the truncated human AIF (AIF△1-400) gene icroscope． MTT test shoan AIF(AIF△1-400)gene can induce the apoptosis of the transfected human HeLa cells. 【Keyk的抑制，也不受Bcl2过量表达的影响［1］，代表着独立于caspase信号通路之外的另一条凋亡途径［5］. 在成功构建AIF△1-120基因的基础上［6］，我们对AIF基因的结构［7］进行了进一步截短并构建AIF△1-400基因，旨在研究其对HeLa细胞的促凋亡活性. 1 材料和方法 1.1材料 pcDNA3AIF△1-120质粒为第四军医大学免疫学教研室构建， E.coli DH5α菌种、 人HeLa细胞系为第四军医大学免疫学教研室保存和培养；载体pcDNA3由第四军医大学免疫学教研室保存；载体pIRES2EGFP（ Clontech公司）；Taq DNA聚合酶，DNA限制性核酸内切酶，T4 DNA连接酶（TaKaRa公司）；新生牛血清（杭州四季青生物公司）；RPMI 1640及脂质体LipofectAMIM2000（ Invitrogen公司）；山羊抗人AIF多克隆抗体（Santa Cruz公司）；FITC标记兔抗山羊二抗（中杉公司）. 1.2方法 1.2.1引物设计 根据AIF的基因序列设计引物为zy1（5′TTT GGT ACC GAA TTC CACC ATG GAG CCC AAT GTT GAG TTG GCC3′）和zy2（5′TTT TCT AGA GTC GAC TCA GTC TTC ATG AAT GTT GAA TAG3′）. 1.2.2AIF△1-400真核表达载体的构建 以质粒pcDNA3AIF△1-120为模板，用zy1和zy2进行PCR,扩增出AIF基因 400位氨基酸密码子以后的片段. 将该基因片段经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后克隆入pcDNA3载体的相应位点， 并转化E.coli DH5α菌株， 挑克隆，提取质粒，酶切鉴定，鉴定正确的克隆由北京奥科公司测序，将测序正确的质粒命名为pcDNA3AIF△1-400. 同时构建绿色荧光蛋白共表达载体pIRES2EGFPAIF△1-400. 1.2.3细胞转染于细胞 转染前24 h，用胰酶消化生长至对数期的HeLa细胞，于放置玻片的24孔板中培养，待细胞达80%汇合率时进行转染. 细胞爬片先用无血清RPMI 1640洗2次，加0.5 mL无血清RPMI 1640. 将1 μg pIRES2EGFPAIF△1-400质粒DNA和2 μL LipofectAMIM2000分别加于50 μL无血清RPMI 1640中，轻轻振摇5 min，混匀，制成转染液，室温静置20 min后，将转染液逐滴加入爬片细胞中，轻轻混合，置37℃孵育6 h，弃去转染液，加含100 mL/L新生牛血清的RPMI 1640. 分别于转染后24，48和72 h取出玻片，用40 g/L多聚甲醛固定5～10 min后，于荧光显微镜下观察细胞形态. 对照组细胞