人参皂苷Rg1激活PI3K-Akt信号通路对6OHDA毒性作用的影响论文.docVIP

　　人参皂苷Rg1激活PI3K/Akt信号通路对6OHDA毒性作用的影响论文 【摘要】 目的 探讨人参皂苷Rg1对抗6羟基多巴胺(6OHDA)毒性作用的信号通路。方法 MES23.5细胞常规培养，免疫印迹法观察人参皂苷Rg1预处理对6OHDA诱导的磷酸化蛋白激酶B (Akt) 表达的影响，MTT法观察细胞的存活率。结果 6OHDA可时间依赖性地降低MES23.5细胞磷酸化Akt的表达(F=24.51,P 0.01)，人参皂苷Rg1预处理可明显增强磷酸化Akt的表达(t=471.60,P 0.01);人参皂苷Rg1预处理可明显降低6OHDA对MES23.5细胞的损伤作用，此作用可以被磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002所阻断(F=25.12,P 0.01)。结论 人参皂苷Rg1通过激活PI3K/Akt信号通路对抗6OHDA对MES23.5神经细胞的毒性作用。 【关键词】 人参皂甙;羟多巴胺;毒性作用;蛋白激酶B;神经元 ABSTRACT Objective To study the signaling pathethod, and the cell survival observed by MTT method. Results 6OHDA inhibited the Akt phosphorylation in a timedependent manner in MES23.5 cells (F=24.51,P 0.01). Pretreatment ent ine; Toxic actions; Casein kinase B; Neurons 帕金森病(PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其主要的病理改变是中脑黑质致密带(SNzc)多巴胺(DA)能神经元功能障碍1,2。PD的病因迄今未明，发病机制十分复杂，研究认为可能与氧化应激、兴奋性毒素、线粒体功能障碍、细胞凋亡等机制密切相关。目前对PD的治疗手段不断发展.freela公司(美国);抗Akt抗体购自Santa Cruz公司(美国);抗磷酸化Akt抗体购自购自Cell signaling公司(美国);LY294002购自Tocrics公司(美国);ECL化学发光试剂盒购自Promega公司(美国);噻唑蓝(MTT)和胎牛血清均购自Gibco BRL公司。MES23.5细胞由乐卫东教授提供(美国贝勒医学院)。 1.2 细胞培养及药物处理 MES23.5细胞接种于96孔板或6孔板，用含体积分数0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培养基，于37 ℃、体积分数0.05的CO2条件下培养。当细胞融合达80%～90%时，分别用在有或无LY294002 (10 μmol/L)存在的情况下，应用Rg1(10-8mol/L)预保护24 h,然后再给予6OHDA(100 μmol/L)，共分为对照组、6OHDA组、Rg1+6OHDA组及Rg1+LY294002+6OHDA组。 1.3 MTT法检测细胞生长 将传代细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为3×103个。当细胞均匀贴壁生长时，在有或者无LY294002共存情况下，先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24 h，再用6OHDA处理，24 h后去除培养液，加5 g/L的MTT 20 μL，于37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱继续培养4 h，每孔中加DMSO 100 μL，混匀后用酶标仪检测波长570 nm处的吸光度(A)值。计算细胞存活率。 1.4 免疫印迹法检测pAkt和Akt蛋白的表达 将传代细胞接种于6孔板中，6OHDA组用6OHDA(100 μmol/L)处理细胞0.5、1、2、4、6 h。Rg1预保护组先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24 h，再用6OHDA处理细胞0.5、1、2、4、6 h，去掉培养液，收集细胞，2 000 r/min离心5 min，沉淀细胞。去掉上清液，用含蛋白酶抑制剂(2 mg/L aprotinin,2 mg/L leupeptin, 1 mmol/L phenylmethylsulfonylfluoride)和磷酸酶抑制剂(1 mmol/L sodium orthovanadate,.freelmol/L NaF)Nonidet P40(20 mmol/L TrisHCl, pH 7.5;150 mmol/L NaCl;1 mmol/L CaCl2;1 mmol/L MgCl2; 体积分数0.10 的glycerol; 体积分数0.01的Nonidet P40)溶液裂解细胞。应用Bradford试剂测定蛋白浓度，取20 μg的蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸5 min，在100 g/