人参皂苷Rg1对帕金森病模型小鼠室管膜下区神经干细胞的作用论文.docVIP

　　人参皂苷Rg1对帕金森病模型小鼠室管膜下区神经干细胞的作用论文 杨赣军 张建平 李庆耀 【摘要】 目的：探讨人参皂苷Rg1促进帕金森病模型小鼠原位神经干细胞增殖分化的作用。方法:C57BL/6小鼠随机分成正常组、模型组和人参皂苷Rg1治疗组。采用MPTP腹腔注射建立帕金森病小鼠模型，利用免疫组化单标和双标技术观察人参皂苷Rg1对小鼠侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖分化的影响。结果：人参皂苷Rg1治疗5 d，侧脑室室管膜下区的5溴脱氧尿苷(BrdU)、神经上皮干细胞蛋白(Nestin)阳性细胞较模型组明显增多，并可见大量从背外侧角沿胼胝体排列的BrdU、Nestin阳性细胞；人参皂苷Rg1治疗20 d，BrdU/Nestin双标细胞的数量较模型组明显增多。结论：人参皂苷Rg1可促进帕金森病模型小鼠脑内神经干细胞的增殖和迁移。 【关键词】 人参皂苷；帕金森病；神经干细胞；室管膜下区 帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中老年神经系统变性疾病，其标志性病理变化为中脑黑质多巴胺能神经元的缺失1。近年来随着神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)研究的深入，利用内源性神经干细胞定向增殖、分化为多巴胺能神经元已成为治疗帕金森病研究的热点。研究发现人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1,Rg1)对MPTP诱导PD鼠黑质神经元凋亡有阻断作用，对帕金森病小鼠SN DA能神经元具有明显的保护作用2；在体内人参皂苷Rg1能否刺激帕金森病模型动物脑原位NSCs的增殖及分化鲜见报道。本研究采用1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶(1ethyl,4phenyl1,2,3,6 tetrahydropyridine,MPTP)制作小鼠帕金森病模型.freelal ventricular zone,SVZ)NSCs的增殖变化以及人参皂苷Rg1的干预作用，为中药防治PD提供更多的实验依据。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物 选用健康雄性C57BL/6小鼠，体重(17±5)g，购自北京维通利华公司动物实验中心。许可证号：SXK京(2004-2006)。 1.1.2 实验试剂 MPTP购自美国Sigma公司，批号：095K1166；人参皂苷Rg1(批号为07032-9812，纯度＞98 %)购自昆明制药厂；兔抗小鼠神经上皮干细胞蛋白(Neuroepithelial stem protin,.freelodeoxyuridine,BrdU)抗体和蛋白酶K均购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化ABC试剂盒、碱磷酶标记链亲合素、碱磷酶底物NBT/BCIP显色浓缩液、DAB试剂盒、磷酸缓冲液(PBS)和枸橼酸缓冲液均购自北京中杉生物技术有限公司。 1.1.3 实验仪器 AE160电子天平购自瑞士METTLER公司；FS/FAS5030石蜡切片机购自德国LETIZ公司；PPTP 30 mg·kg-1，连续5 d。 1.2.2 分组及处理动物随机分为正常组6只，不作任何处理；模型组12只，造模后不作任何处理；人参皂苷Rg1治疗组12只，从造模第1天开始每天腹腔注射人参皂苷Rg1注射液70 mg·kg-1。各组动物的存活期分别是开始造模后的5 d和20 d。 1.2.3 取材及处理用10%水合氯醛按0.04 mg·kg-1体重对小鼠腹腔麻醉，经左心室升主动脉灌流固定后，取脑，后固定6 h，脑经脱水、透明、石蜡包埋，做冠状切片，片厚6 μm，常温保存备用。 1.2.4 免疫组化法(ABC法)常规组织切片脱蜡至水后加新配制1% H2O2甲醇溶液处理20 min；0.01 M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)92℃热修复10 min，自然冷却至室温；胃蛋白酶K消化(37℃)20 min；以上各步之间都采用0.01 M PBS洗涤5 min×3次。再滴加正常山羊血清工作液，37℃，20 min；吸干血清，分别加入一抗小鼠抗PA抗体(1∶50)，兔抗小鼠Nestin抗体(1∶200)，4℃，48 h～72 h；滴加二抗37℃，2 h；滴加三抗37℃，2 h；滴加显色剂DAB底物溶液显色，显色时间10 min～30min；在滴加一抗至三抗后都采用0.01 M PBS洗涤5min×3次。切片双蒸水冲洗，酒精梯度脱水、二甲苯透明、光学树脂封片；阴性对照切片不加一抗，其他处理同上。光镜观察切片，细胞内棕色颗粒为阳性颗粒。 1.2.5 BrdU/Nestin免疫双标方法首先按常规免疫组织化学ABC法显示核抗体BrdU，显色液为碱性磷酸酶NBT/BCIP显色浓缩液，阳性胞核为蓝色；再按ABC法显示Nestin的表达，底物显色剂为DAB，阳性胞浆为棕色颗粒。光镜观察切片，胞核为蓝色颗粒