人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定论文.docVIP

　　人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定论文 【摘要】 目的 获得纯化人突变CD59(hmCD59)蛋白，制备其特异性抗体，对纯化产物进行鉴定。方法 将含有hmCD59全长序列的重组pALTER质粒,运用脂质体介导法转染CHO细胞,采用SDSPAGE检测hmCD59的表达情况，表达产物经ANTIFLAG M2 Affinity Gel纯化后制备抗血清，以此抗血清鉴定纯化产物。结果 hmCD59在CHO细胞获得表达，ANTIFLAG M2 Affinity Gel纯化后可获得电泳纯的hmCD59蛋白，hmCD59与小鼠抗hmCD59抗血清具有特异性反应。结论 从真核细胞获得了电泳纯并具有抗原性的hmCD59蛋白，为进一步对其进行抗体制备、功能研究及临床应用奠定了基础。 【关键词】 人突变CD59 真核细胞表达 纯化 抗原性 ［ABSTRACT］ObjectiveTo obtain purified human mutant CD59 (hmCD59) protein and to identify the purified product against hmCD59 protein.MethodsThe rebinant pALTER plasmid containing hmCD59 cDNA ine. Expression of hmCD59 on CHO cells CD59 and used to identify the purified hmCD59.ResultshmCD59 protein ore, hmCD59 had specific reactivity ouse antihmCD59 antiserum.ConclusionThe purified hmCD59 protein has been obtained successfully, CD59. ［KEY AC沉积增加，内皮释放生长因子，引发糖尿病病人血管增殖［4］。人类糖尿病血管并发症发生的潜在机制仍然不十分清楚，尤其是hmCD59与糖尿病并发症的相关性鲜有报道。本研究报道hmCD59蛋白的表达、提取、纯化及抗原性鉴定，为下一步制备抗hmCD59单克隆抗体并对其进行临床应用研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 质粒、菌株与细胞株 质粒hmCD59PALTER由本室构建保存。pcDNA3由美国哈佛大学提供。CHO细胞株由本室保存。 1.1.2 主要试剂 EcoRⅠ购自宝生物大连有限公司。RPMI 1640培养基购自HyClone公司。小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。G418选择性抗生素购自于Amresco公司。LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品。ANTIFLAG M2 Affinity Gel FreezerSafe为SigmaAldrich公司产品。Vivaspin 2超滤浓缩离心管为Sartorius公司产品。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为Sigma公司产品。HRP标记的羊抗小鼠IgG为北京中山生物技术有限公司产品。其他试剂均为国产或进口分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 质粒hmCD59PALTER的鉴定 将hmCD59PALTER质粒经EcoRⅠ酶切鉴定并经上海生物工程公司测序确认。 1.2.2 hmCD59在CHO细胞中的表达 重组质粒hmCD59PALTER对CHO细胞的转染,参照LipofectamineTM 2000的说明书进行。转染后24 h将细胞作1∶10稀释后传代,48 h后加入选择培养液(含有800 mg/L的G418)筛选阳性克隆2周，挑取单个克隆,继续抗性筛选2周,.freelg/L)下进行。收集生长状态良好的阳性CHO细胞，裂解后离心取上清以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）鉴定蛋白的表达。 1.2.3 目的蛋白hmCD59的纯化 获取生长良好的107～108个转染CHO细胞 ，加入细胞裂解液(含50 mmol/L Tris HCl,pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA,体积分数0.01的TRITONX100)10 mL,冰上振荡裂解30 min后低温离心取上清待用。将ANTIFLAG M2 Affinity Gel装柱并静置，待填料完全沉降后，用TBS （其中含50 mmol/L Tris HCl,150 mmol/L NaCl, pH 7.4)冲洗，连续加3次柱体积的0.1 mol/L甘氨酸HCl (pH 3.5)洗胶，再以TBS在4 ℃平衡树脂。加入总蛋白提取物，在重力作用下多次流经亲和柱，保持 4 ℃，控制流量为1