人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的克隆及其载体的构建论文.docVIP

　　人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的克隆及其载体的构建论文 李昕,王平,李刚,刘屹立 【关键词】 受体;,肾上腺素能β3;,载体 β3AR gene cloning from human bladder detrusor smooth muscle and construction of its antisense eukaryotic expression vector 【Abstract】 AIM: To clone human beta3 adrenoceptor (β3AR) gene from human bladder detrusor smooth muscle and construct its antisense eukaryotic expression vector. METHODS: The β3AR fulllength cDNA plified from human detrusor muscle cells through RTPCR (BamHI and ClaI sites primer, and HindIII into do) and subcloned into clone vector (pUC18). The target gene ClaI/HindIII sites of pUC18 e as designed by restriction endonuclease analysis and sequencing. CONCLUSION: β3AR fulllength cDNA human bladder smooth muscle and their antisense eukaryotic expression vectors HI及ClaI酶切位点，下游引物加有HindIII酶切位点，将该片段插入pUC18载体中，摇菌扩增后，用ClaI和HindIII切下目的基因，然后将目的片段反向插入逆转录病毒表达载体pLNCX上. 最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定. 结果：经琼脂糖凝胶鉴定.freelin，再放入-70℃冰箱中保存. pUC19购于Takara公司；逆转录病毒载体plncx购自Invitrogen公司；JM109大肠杆菌感受态菌株购自Takara公司. 限制性内切酶和DNA工具酶BamHI，HindIII，ClaI等内切酶购于华美生物有限公司；RNase和T4DNA连接酶购于Promega公司. Trizol试剂及RNA LA PCRTMKit(AMV)购自大连宝生物公司；QiAquick Gel Extraction Kit购于Qiagen公司；质粒提取试剂盒购自Gibco公司. 1.2方法 1.2.1人膀胱逼尿肌中β2AR全长基因的克隆称取冰冻状态下的膀胱逼尿肌组织约200 mg，采用宝生物公司的Trizol试剂并按使用说明书操作提取总RNA，10 g/L低熔点琼脂糖凝胶鉴定RNA的含量及完整性. 根据Genebank提供的β3AR基因序列（NM_000024）采用Oligo6.6软件设计如下两对引物，外引物及内引物，应用套式PCR来扩增目的基因. 内引物：上游引物F01： 5′CCGGATC CATCGATATGGGGCAACCCGGGAACGG3′, 下游引物R01： 5′AGGAAGCTTTTACAGCAGTGAGTCATTTG3′; 外引物：上游引物F02： 5′TGCGCTTACCTGCCAGACTG3′, 下游引物R02： 5′GCCCTTCCTTCTGCATATCTC3′. 其中内引物是针对蛋白质编码区（CDS:220~1461 bp）设计的，其上游加有BamHI及ClaI酶切位点，下游加有HindIII位点，使其能反向连接在pLNCX的多克隆位点上. 外引物F02，R02可扩增βAR cDNA第194~1587 bp. 引物由大连宝生物公司合成. 取总RNA 1 μL采用宝生物公司的RNA LA PCRTM Kit(AMV)试剂盒进行RTPCR反应. 取8 μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶跑电泳，并用BIORAD Flus凝胶图像处理系统进行图像分析. 1.2.2β2AR基因反义真核表达载体的构建PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶跑电泳除杂质，并用柱式PCR产物回收试剂盒回收. 回收产物与pUC18克隆载体分别用BamHI和HindIII酶切后在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜连接. 取连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，涂布含有氨苄青霉素、IPIG和Xgal的平板，37℃过夜培养，挑取白色菌落并作标记，通过菌落PCR鉴定阳性重组克隆. 将含有阳性重组质粒的菌落挑入适量LB培养液中，37℃培养过夜，