人骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响论文.docVIP

　　人骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响论文 .freelan Mesenchymal Stem Cells on Cell Proliferation and Chemo-sensitivity of K562 Cells Abstract This study ed to pare K562 cell proliferation，chemo-sensitivity and alteration of MDR1 before and after adhesive culture odrug-resistance of leukemia cells and hemopoietic microenvironment. K562 cell cultivated in suspension and adhesively cultivated ined by floetry; the effect of chemotherapy on cellular viability and apoptosis of K562 cell ined by RT-PCR. The results shoycin-inducing apoptosis，K562 cell apoptosis in the adhesive culture o-resistance of K562 cells take place.The mechanism，hos not relevant esenchymal stem cell; K562; drug resistance; apoptosis; MDR1 耐药是根治白血病的最主要障碍，其发生机制及逆转的研究一直是白血病的研究热点，以往人们主要集中在对单个白血病细胞本身的分子生物学改变的研究，并取得了显著成果，但在体内仍难克服耐药的发生。近年来，随着对骨髓造血微环境（hematopoietic microenviroment，HM）的认识不断加深，发现骨髓基质细胞在白血病细胞恶性克隆的增殖、分化和凋亡中起重要作用［1］。而骨髓基质细胞的前体细胞骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是骨髓造血微环境中基质细胞的主要来源，对正常造血也具有调控作用，但对白血病细胞的调节作用尚不清楚。本研究以人慢性髓细胞白血病K562细胞株为靶细胞，与正常人MSC共培养，观察其对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响，以探讨MSC与白血病耐药的关系。 材料和方法 试剂 柔红霉素、阿霉素（DNR、ADM)，均购自Pharmacia公司；DMEM-LG、RPMI 1640培养液购自Gibco公司；FBS 购自Hyclone公司； RT-PCR试剂盒、蛋白酶K、RNA酶及琼脂糖均购自Promega公司； PCR引物由上海生物工程公司合成。TRIZOL购自Invitrogen公司；Percoll(密度1.073 g/ml)，购自Amersham Biosciences公司。碘化丙锭（PI）购自美国Coulter-Immunotech公司。 人骨髓MSC的分离和培养 骨髓MSC的分离、纯化和扩增按Pittenger等［2］报道的方法进行。取肝素抗凝健康自愿者骨髓液5 ml，用Percoll分离液分离单个核细胞（MNC），以2.0×105/cm2细胞接种于75 cm2的Nunc培养瓶内，培养体系为含10% FBS的DMEM-LG，置于37℃、5% CO2饱和湿度的孵箱中进行原代培养。培养48小时后换液，除去非贴壁细胞，以后每3天换液1次。待覆盖培养瓶底面积的80%以上时加入0.25%胰蛋白酶消化传代，按5×103/cm2传代培养，每3天换液1次。2-4代细胞用于实验。 人骨髓MSC表面标志的鉴定 将胰蛋白酶消化收获的MSC以2×105个细胞分别与抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD105、CD166、HLA-A/B/C和HLA-DR（PharMingen公司）室温反应30分钟，经PBS洗涤2次后与标记FITC的二抗避光反应15分钟，细胞洗涤后悬浮于PBS中以备流式细胞仪分析。 K562细胞与MSC黏附培养 K562/ADM细胞株，购于中国医学科学院血液学研究所，在ADM 1.0 μg/ml的含10% FCS的RPMI 1640培养液中稳定生长。试验前2周换用无ADM的培养液培养。K562细胞株由本医院中心研究室提供，培养体系同上。已传代的MSC以1×104 /cm2接种于75 cm2的培养瓶中，待细胞贴壁呈融合状态时在其上分别直接加入对数生长期的K562和K562/ADM细胞（1×105/ml）。48小时后先去除未黏附的白血病细胞，根据文献报道方法［3］吹打收集黏附