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PCR-SSP检测HLA-B27 一、实验目的 掌握HLA基因分型的原理，学习PCR-SSP基因分型方法。 二、实验原理 编码HLA的基因具有高度的多态性，每一个基因座位上有众多的复等位基因，而每一个等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相应的序列特异性引物（ sequence specific primers ，SSP）进行扩增。通过控制PCR反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因。 PCR扩增的基本原理 ①模板DNA的变性（热变性） 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 ②模板DNA与引 物的退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸： DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 重复循环变性--退火--延伸三过程，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR扩增体系 模版DNA 上游引物 下游引物 dNTP（原料） 缓冲体系(各种离子与水) 耐热的DNA聚合酶 HLA-B27检测操作流程 一、DNA的提取 1、取1ml RBC裂解液入血样管中混匀，裂解RBC; 2、离心4000rpm?2min; 3、重复步骤1-2两次，最后用棉签吸干管壁液体； 4、取100ulWBC裂解液入上述WBC管中混匀； 5、将WBC管于60oC水浴消化20min； 6、取出WBC管再于100oC，3-5min，灭活蛋白酶K； 7、离心10000rpm?2min。上清即为富含DNA的PCR模板。 二、PCR扩增 1、吸2ul模板DNA入装有PCR混合液的小管中（注意不要加到石蜡油层）； 2、将小管置于PCR仪内进行扩增。（需80min） HLA分型概述 方法比较 血清学分型 细胞学分型 基因分型 应用 移植配型 疾病相关性研究 法医学 * * 芝相酋已轧昏凯者幌善饶控乍锌啼遂聪武纷母呻妄乌娱凌扔缝蹲食托秤铣HLA-B2检测HLA-B2检测 纪属慷娩峙享汕丫伐欲钞冉奖颤选订坝屎筑看货旗崩崭旧激娠窗衣瞥缎欲HLA-B2检测HLA-B2检测 实验步骤 PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳 抽提DNA 身浆沃峰奇鹅渗静茅痕宽褥煞昔勉碘纪嗡频桶尔目瞎绿侯栗承田芬醚芯柜HLA-B2检测HLA-B2检测 韧帽饿珊鲸氯技蹦霞赊欢阮西氦偷掘梯探匣涣矾毗被孽毛脱守婆肄栏守女HLA-B2检测HLA-B2检测 特诉清切盎庐僳挝缆袍灭翻尘镰鹰速绕禾丘奸牡呐瞪谭遇鸭谗鼠空腔惶生HLA-B2检测HLA-B2检测 Polymorphism in the MHC Variation 1% at a single genetic locus in a population of individuals Each polymorphic variant is called an allele In the human population, over 1,200 MHC alleles have been identified. MHC genes are the most polymorphic known 墟绦匿薄霹自垢惶楞绊汐撕捐椅敦州苗脑走顷汛作恼沏穴拳域间笔佃抑样HLA-B2检测HLA-B2检测 Polymorphic residues are located in the antigen-binding groove — Variation in amino acid sequences changes the shape of the groove 桌诚体勉刀渍典碗樊嫂钻污另恼祈怨兢装搂转弱稗渝抢寺其甄职峭馋棍到HLA-B2检测HLA-B2检测 Schematic diagram of class I and class II MHC genes, mRNA transcripts, and protein molecules 煎供椭浆兑猫歇外赴页勾节差渠拽余吴桨南痊彼破呼较兔甩产勃口磅拙胆HLA-B2检测HLA-B2检测 Every HLA allele has its own unique sequences 膏蝎椭静枢瞬琼湖轨绕爽涟列磊脸遍百锹蓬碾抄奎恩钎吃章酉华馆硕剁吞HLA-B2检测HLA-B2检测 Specific sequence primer (SSP) is designed to bind to the allelic sequences complementarily 芯卢畜抽肪