丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠海马APP表达的影响.pdf

物学及蛋白水平的作用机制，可以让临床医生更准确地理解和把握该药的作用机 制和临床适应症，为该药治疗慢性脑缺血提供理论依据。 材料和方法： 1．动物分组与模型制备： 试验动物选用健康Wistar大鼠150只(郑州大学实验动物中心提供)，雌雄不拘， 低剂量组(D)和高剂量组(E)，共5组，每组30只。假手术组仅暴露双侧颈总动脉 而不结扎，余各组采用双侧颈总动脉结扎(2Vo)法制备动物模型。c组先给予丁基 苯酞80ng．Kg-1．d一，1月后停药，行2VO术；B组正常饲养2月后仅给予安慰剂；A、 D、E组行2VO术，正常饲养2月后，A组给予安慰剂，D组给予丁基苯酞60mg．Kg～．d～，E 组给予丁基苯酞120mg．Kg一．d一．连续灌胃1个月：共3fl后处死动物。 2．标本采集： ①免疫组织化学法标本采集：麻醉动物，37‘C生理盐水灌洗后断头迅速取出脑组 织，放入4％多聚甲醛中后4C冰箱内固定24d,时，经梯度酒精脱水，二甲苯透明， 石蜡包埋，制作脑部冠状石蜡切片(厚度3um)，以备免疫组化染色。 ②RT—PeR及免疫斑点法标本采集：麻醉动物，断头取血后迅速冰上分离脑组织， 装入1．5mlEP管中，一80℃保存，以备RT—PCR及免疫斑点实验使用。 3．免疫组织化学法 ①抗体：一抗兔抗APP单克隆抗体 二抗HRP标记山羊抗兔多克隆抗体 ②免疫组织化学染色步骤：烘片、脱蜡至水、抗原修复、血清封闭、加一抗、加 二抗、DAB显色、苏木素复染、分化、封片、照相； ⑨图像分析 4．嗣卜PCR： ①组织总RNA提取：超低温冰箱取标本，迅速冰上分离，取出其中一侧海马，用 和含量。 ②逆转录一聚合酶链反应： 木 3’ 弓I物B—Actin：5’GGGA从TCGTGCGTGACAT 5’ TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3’ 7 APP：5 GGGTCTGGGTTGACAAACATC3’ 7 5 CATTCTGCTGCA代TTGGAGA3’ 术 25ul体系，50C，15min，cDNA合成； 94℃，2min，预变性： 94C，30s，变性； 56。C，30s，退火；(经过反复试验确定最适退火温度为56。C) 72℃，1．5min，延伸； 4℃．forever． 掌 琼脂糖凝胶电泳配制2％琼脂糖凝胶，lOxBuffer上样，EB染色。 ③图象分析 5．免疫斑点实验： ①组织总蛋白提取：取另一半海马用单去污裂解液法提取组织总蛋白。 ②免疫斑点实验： 幸 APP单克隆抗体 抗体一抗：小鼠抗大鼠IgGl 二抗：HRP标记羊抗小鼠IgG多克隆抗体 幸 步骤组织总蛋白液(即抗原液)按1：20稀释； 脱脂奶粉室温下封闭14,时； TBS液洗膜滤纸吸干后加入一抗，室温下摇床混匀44,时： TBS液洗膜滤纸吸干后加入二抗，室温下摇床混匀44,时； TBS液洗膜滤纸吸干后加入DAB显色液显色，室温下卜3分钟； ③图象分析 6．统计学处理 应用SPSSl3．0统计软件进行数据处理。实验数据用均数±标准差(；±s)表示。 多样本均数间比较采用单因素方差分析及Q-检验法处理。以a=O．05作为显著性 检验水准。 结果： 1．实验各阶段对大鼠进行一般行为学评价显示：造模成功后大鼠均出现精神萎 靡、反应迟钝、少食、少饮；术后1天，假手术组精神恢复，余组改善不明 显，部分大鼠出现共济失调，无明显肢体瘫痪；3-5天后逐渐恢复，1周后 基本正常，体重恢复，伤口逐渐愈合；灌服药物干预后，预防组、低剂量组、 高剂量组大鼠行为学均较模型组明显改善，高剂量组改善最明显。 2．免疫组织化学染色见大鼠海马CAI区假手术组细胞排列正常，细胞胞膜及 胞内APP染色较浅，模型组细胞排列紊乱，锥体细胞形态异常，APP染色 沉着明显；预防组细胞排列及细胞形态较模型组明显改善，APP染色沉着减 少；低剂量组细胞排列紊乱情