中国石斛属系统发育及铁皮石斛的保护遗传学研究.pdf

摘要 摘 要 石斛属 (Dendrobium) 为兰科 (Orchidaceae) 第二大属，我国有 74 种 2 变种， 经典的形态分类系统对该属下组的划分存在着一些争议。本研究首先根据 rDNA ITS 序列对中国 62 种石斛属植物涵盖了 12 个组的系统发生关系进行了探讨，构 建了 NJ 和 MP 两个系统发育树。结果表明：由禾叶组的双花石斛和小双花石斛 组成了最基部的一支，剩余的 60 种则分为两大支，其中，距囊组、基肿组、剑 叶组和草叶组这4 个组构成了一支，另外一支则由石斛组、黑毛组、叉唇组、顶 叶组、瘦轴组、圆柱叶组、心叶组和和叶组构成。且第二大支中，存在着组与组 之间的物种相混杂在一起的现象，这可能是由于石斛组物种繁多且亲缘关系不明 确导致的。这一现象预示少数按照经典形态特征划分的组与分子系统没有呼应， 个别分组尚待商榷。 铁皮石斛(Dendrobium officinale)为兰科石斛属植物，是我国特有的珍稀濒危 物种。铁皮石斛是一种传统名贵中药，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、润 喉明目的功效。铁皮石斛自然繁殖率低，加上长年无节制的采挖，该物种已经日 趋枯竭。因此，亟待需要开展铁皮石斛的种质资源与保护遗传学的研究。本论文 开展了铁皮石斛组织培养研究、遗传多样性及遗传结构的研究，旨在为合理利用 及保护铁皮石斛资源提供科学依据，对于保护和利用该濒危物种有着重要的意 义。 本研究采用不同的基本培养基，添加各种浓度比例的激素，对铁皮石斛茎段 诱导侧芽及丛生芽展开了研究。采用三因素三水平的正交试验设计了 9 组试验， 诱导丛生芽的产生，统计丛生芽增殖系数，筛选出铁皮石斛茎段诱导芽的最优配 方组合。 为探讨铁皮石斛遗传多样性和居群遗传结构，本论文通过扩增片段长度多态 性的分子标记方法，对 12 个居群的 71 个铁皮石斛个体展开研究。经过 4 对选择 性引物扩增后共得到 192 条条带，所得条带范围是 100-500bp。结果表明，铁皮 石斛在种的水平上拥有较高的遗传多样性，其中多态性条带有 164 条，多态位点 百分率(PPL)为 85.42%，香农信息指数(IS)为 0.4100，期望杂合度(He)为 0.2688 。 但居群水平上多样性则偏低(PPL = 40.82%, IS = 0.2203, He = 0.1477) 。AMOVA 分 析表明居群内的变异占主要部分，约有 73.03%变异发生在居群内部，而居群间 的变异占总变异的26.97% 。UPGMA 聚类树上看，广西乐业居群与其他 11 个居 群的遗传距离最远，成为最基部的一支。其余居群分成 2 个大支，第一大支中的 居群主要分布与我国西南部省份，而第二大支中的居群则主要分布于我国东南部 省份，与 PCO 分析的实验结果相似。另外，PCO 分析还表明，不同居群的个体 I 摘要 间有相互重叠和相互混杂的现象，而这一现象就恰好说明个体间的遗传关系与他 们的空间分布上缺少明显的关联，与 Mantel test 检测的结果相呼应。自交不亲和， 较为广泛的地理分布和较长的生命期限可能是其拥有较高遗传多样性的原因。分 化指数 Φ 表明铁皮石斛居群间存在有中等水平的遗传分化。居群间的基因流 ST Nm 值为 0.67，基因流小于 1，将不足以抵制潜在的遗传漂变可能带来的后果。 本论文还对铁皮石斛的微卫星标记进行了开发。利用磁珠富集法构建铁皮石 斛微卫星文库，筛选出有效的SSR标记，共获得8对多态性引物。通过对3个居群 的15个个体的扩增发现：每个位点的等位基因数目为2-4个，多态信息含量PIC为 0.357-0.671，期望杂合度为0.480-0.747，说明铁皮石斛拥有较高的遗传多样性。 遗传分化系数 (Fst) 反映出这三个铁皮石斛居群的分化处于中度分化程度。铁皮 石斛微卫星的开发为进一步研究其保护遗传学，亲缘地理学的问题奠定了基础。 关键词：石斛属，rDNA ITS ，系统发育，铁皮石斛，组织培养，遗传多样性， 遗传结构，AFLP ，SSR II