生物化学蛋白质的性质实验.docVIP

生物化学实验讲义  实验一 蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的呈色反应及蛋白质的沉淀反应 实验目的 1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 4．加深对蛋白质溶液的胶体性质的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。， 一、茚三酮反应 1.实验原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。 该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。 此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 2.材料、仪器与试剂 蛋白质溶液；新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液 3.实验操作 ①取2支试管分别加入鸡蛋清溶液和0.5%甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 ②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 二、黄色反应 1.实验原理 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。 2.材料、仪器与试剂 鸡蛋清溶液；大豆提取液(将大豆浸泡充分吸胀后，研磨成浆状用纱布过滤)；头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；10%氢氧化钠溶液 3.实验操作 向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。 管 号 1 2 3 4 5 6 7 材 料 （滴） 鸡蛋清 溶液 4 指甲 少许 头发 少许 0.3% 色氨酸 4 0.3% 酪氨酸 4 浓硝酸/（滴） 2 4 40 40 4 4 4 现象 三、蛋白质沉淀反应 蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出，此现象叫蛋白质的沉淀反应。 （一）蛋白质的盐析作用 1.实验原理 盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐 析作用与两种因素有关：① 蛋白质分子被浓盐脱水；② 分子所带电荷被中和。 蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及 pH 有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如清蛋白)易于析出。球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。 2.材料、仪器与试剂 鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；固体硫酸铵；饱和硫酸铵溶（ 称取377 g硫酸铵溶于20℃500ml 的蒸馏水中。硫酸铵在20℃水中的溶解度为754g/L水。配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在，同时可加热助溶）。 3.实验操作 取鸡蛋清溶液约 5ml 于试管中，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静止数分钟则析出球蛋白沉淀。将管内混合液过滤，向滤液中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。 （二）重金属盐类沉淀蛋白质 1.实验原理 溶液 pH 在蛋白质等电点以上时，重金属盐类(如 Pb 2+ 、Cu 2+ 、Hg 2+ 及 Ag + 等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。 2.材料、仪器与试剂 鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；5％CuS04 溶液；3％AgNO3 溶液 3.实验操作 取试管 2 支各加蛋白质溶液 1ml，向各管分别滴加 2-3滴加 5％CuS04