转基因技术操作.ppt

Tankertanker Design Tankertanker Design Tankertanker Design Tankertanker Design Tankertanker Design Tankertanker Design Tankertanker Design 转基因技术操作 目录 CONTENTS 载体及相关工具 结扎雄鼠 显微注射 胚胎移植 后代观察 载体及相关工具 载体介绍 1 相关工具准备 2 载体简介 注: 此慢病毒质粒载体的全长8860bp。由多种功能元件组成，其中包括5‘端和3’端的长末端重复序列(LTR)，含有启动子、增强子、整合信号及多聚腺苷化信号等调控序列；CMV启动子能够在宿主细胞中持续表达外源基因的作用，同时能驱动的绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因eGFP ，可用于感染效率的检测；稳定筛选标记嘌呤霉素抗性基因Puromycin；复制起点pUCori以及氨苄青霉素抗性基因Amp组件等。 相关工具准备 玻璃毛细吸管（移卵针）制作： 1．双手持毛细玻璃管，将其中部在酒精灯上进行烧灼加热，当玻璃管中部变红并充分软化时，从火焰上离移开并快速向两侧外拉。2．在火焰上将拉长后的毛细玻璃管烧断，形成两均等的毛细吸管。3．用安瓶切割砂轮切断毛细玻璃吸管，留10cm 长左右。4．在酒精灯上微微加热毛细吸管，使其头部吸口微缩、光滑。注意，过热的温度可能使吸口封住。 移卵针 结扎雄鼠 5%苯巴比妥钠2.4ml麻醉6周以上的ICR雄鼠（腹腔注射）； 腹部向上呈仰卧状，剪净手术部位被毛，75%酒精从内向外消毒手术部位； 剪开约1cm切口，分离皮肤、肌肉层； 找到输精管，用丝线结扎输精管两端，剪断输精管，用钝头镊子将整个器官送回腹腔； 相同的方法处理另一边输精管； 依次缝合肌肉层及皮肤切口。 结扎雄鼠 结扎雄鼠 转基因动物 转基因动物：转基因动物是指将特定的外源基因导入动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于动物的染色体基因组并能稳定遗传给后代的一类动物。 根据外源基因导入的方法和对象的不同，目前制作转基因动物的方法主要有显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)法、电脉冲法、精子载体导入法等。 操作流程图 供体鼠超排 与种公鼠合笼 取胚 显微注射 胚胎移植 F1代检测 提取质粒载体 病毒包装 受体鼠与结扎鼠合笼 供体鼠超数排卵法 PMSG（孕马血清促性腺激素）和HCG（人促性腺激素）间隔48h腹腔注射，促进供体母鼠（B6，6-8周）排卵； 注射后与种公鼠（B6，6-8周）合笼交配； 同时将发情受体母鼠（ICR，6-8周）与结扎过的公鼠（ICR,6-8周）合笼交配，制作假孕母鼠模型； 检查阴栓，见栓表示交配成功，准备下一步处理。 检查阴栓 取胚胎 颈椎脱臼处死供体母鼠，打开腹腔，取输卵管壶腹部，置于M2培养液*中； 在体视显微镜下，与M2培养液*中用眼科镊撕开壶腹部，可见释放出来的受精卵； 用事先准备的移卵针吸取受精卵置于新鲜M2培养液中清洗3-4次； 放置于37℃，5%CO2培养箱中待用。 * 为M2培养液中加入了透明质酸酶 显微注射 凹形载玻片 矿物油 M2培养液 显微注射 显微注射 调节持卵针、注射针和受精卵细胞,使之处于同一焦聚平面； 持卵针减压吸住受精卵，含有病毒悬液的注射针分别从受精卵上极、下极以及中轴线3个角度刺入透明带进入卵周隙； M16培养液培养并观察存活率和分裂情况。 显微注射 胚胎移植 取见栓的假孕母鼠，麻醉，在背部输卵管壶腹部处开口，暴露出膨大的壶腹部； 用移卵针先吸取一些M2培养液，后吸入一个小气泡，再吸入含有受精卵的M2培养液，再接着做一个小气泡，吸取一小段M2培养液； 用组织镊夹住卵巢上的脂肪堆，将卵巢、输卵管及子宫网上拉出体外，在体视显微镜下找到膨大的壶腹部，用眼科镊固定好壶腹部，后用尖利的针头在靠近卵巢的膨大的壶腹部前刺开一个小口； 用移卵针插入小孔，轻轻吹出受精卵直到2个气泡完全进入输卵管； 将脏器放回腹腔，缝合。做完移植手术的小鼠放回笼子，保温37℃直到清醒。 M2培养液 气泡 含受精卵的M2培养液 M2培养液 受精卵 移卵针气泡位置图示 观察F1代基因表达情况 代孕母鼠产下F1代后，待F1代没有长出被毛之前，可用蓝光手电筒检测小鼠全身有无绿色荧光表达，有则表示外源基因随着载体转入成功； 待F1代离乳后（一般在出生后21天），可剪一小段鼠尾，提取组织中的DNA，利用特异的GFP引物对其扩增，从DNA层面检测外源基因的导入情况。 GFP扩增结果 100bp 200bp 300bp Maker 阴性对照 1 2 3 4 5 6 Tankertank