酶免疫分析.docVIP

免疫分析法（immunoassay，IA）是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。由于疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。 1、酶免疫分析（EIA） 酶免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术，以酶标记抗原或抗体作为示踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光，达到定量分析的目的。这种方法是对细胞融合技术的一项重要应用。因其操作简便，不需昂贵设备，不污染环境，加之酶标记物相当稳定，有效期长，应用范围广泛而受环境检验工作者青睐。最初应用的EIA技术，多采用HRP标记抗体或抗原，灵敏度不高。后来逐步发展了各种放大体系，如底物循环放大体系、酶联级放大体系、生物素-亲和素放大体系、脂质体或红细胞等作为标记物载体以包载大量标记物的放大体系，以及采用PCR技术的PCR-EIA分析，使灵敏度有很大改进。 1.1生物素-链亲和素酶免分析（biotin avidin system BAS-EIA）[1] 生物素（botin）广泛存在于动植物组织中，在生物体内是羧化酶的辅酶；亲合素又名抗生物素蛋白，与生物素具有高度的亲和性，利用这一点，以生物素和亲和素为中介，可增强抗原-抗体反应的结合提高检测方法的灵敏度。但亲和素的非特异性结合高，后又发现另一种亲合素，称之为链亲合素（Streptavin，SA），克服了亲合素非特异性结合高的缺点。免疫分析技术中，目前均采用SA供标记酶或其它示踪剂。一个完整的SA分子上的4个相同亚基，都可以和一个生物素分子结合，其Ka值达1015L/mo1，是抗体抗原反应的10~100万倍。又加之一个抗体或抗原分子结合多个生物素分子，不改变其免疫活性。 1.2脂质体免疫分析法（liposome immunoassay，LIA）[1] 脂质体是一种生物摸拟膜，它是磷脂分子分散于水相介质中形成的密闭的双子单层或多层的囊泡。其膜内可包容上万个标记物分子，具有很高的信号放大作用。因此，将脂质体用于免疫分析是提高非放射免疫分析灵敏度的有效途径之一，由此所建立起来的方法即为脂质体免疫分析法。 1.3PCR-EIA分析[1] PCR-EIA技术是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，它以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，由PCR产物的量来反映抗原分子的量。由于PCR的高扩增能力，只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。 1.4酶联免疫吸附测定法（ELISA）[2] ELISA是一种主要的免疫分析方法，又可分为直接竞争法、接竞争法、双抗体夹心法和间接夹心法。直接竞争法是将抗体包被到聚苯乙烯微孔反应板上，加入酶标记农药和待测农药，酶标记农药和待测农药之间与抗体的竞争而发生结合反应。由于待测农药多，则反应后被吸附到反应板上的酶标记农药少，即吸附到酶反应板上的酶标记农药的量与待测液中农药的含量成反比。加入酶底物显色后，进行比色，可以测定待测农药含量。间接竞争法的前一部分与抗原包被直接竞争法相同，只是不用酶标记农药抗体（一抗），而是标记第一抗体，在竞争反应结束后，加入酶标一抗，发生一抗与酶标一抗的结合反应，被结合的酶标一抗的量与包被抗原结合的一抗的量的变化趋势是一致的，即被结合的酶标一抗的量与待测农药的含量成反比。此方法的优点是一个农药抗体可以结合多个酶标一抗，大大提高了方法的灵敏度。双抗体夹心法是将抗体包被固相载体，加入待测抗原使其与过量的固相抗体结合，再加入过量的酶标记相同的抗体，分离固相和游离相的化合物，加入底物，据显色程度来求出样品中抗原的含量。间接夹心法是将样品中的抗原结合于过量的固相抗体，加入过量的同种抗体（一抗），洗涤后加入酶标一抗，最后加入底物反应，据显色程度确定待测抗原的含量。 2、免疫分析技术在环境领域中的应用 1960，Yalow和Berson年第一次应用免疫分析技术检测血清中的胰岛素。随后，免疫分析技术迅速发展起来，但主要集中在生物化学、临床医学等领域。直到20世纪80年代免疫分析技术对环境化学物质检测的应用才受到了重视。 1971年，Ercegovich首先提出了将免疫化学方法应用到环境领域。他建议用免疫学的筛选方法快速检测农药残留。1975年，杀虫剂、艾氏剂和狄氏剂的放射免疫分析作为免疫分析应用于环境污染物检测领域第一次报道出来。在初始阶段，研究者将注意力集中在了农药的免疫学分析中，他们做了大量的工作，所用的技术主要是放射免疫法（RIA）。1972年，Vanweemen和Engavall等人建立了酶免疫测定方法（enzyme immunoassay，EIA）。1975年，Koh ler和Mil-stein利用杂交瘤技术制备出单克隆抗体（McAb）。但是由于各方面条件的限制，这两