第七节分解纤维素的微生物的分离.doc

　　 微生物的培养与应用 课题3　分解纤维素的微生物的分离 主讲：黄冈中学优秀生物教师　王小敏 一、基础知识 （一）纤维素与纤维素酶 1、纤维素 　　纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。 　　植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。 2、纤维素酶 　　纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即CX酶、 C1酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。 （二）纤维素分解细菌的筛选 分解纤维素的微生物，有各种细菌、真菌和少数放线菌。 1、筛选方法：刚果红染色法。 2、筛选方法的原理： 　　刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 二、实验设计与操作 （一）土壤取样 1、取样环境：选择纤维素丰富的环境。 2、理由： 　　由于生物适应一定的环境，环境对生物有选择作用，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。 3、实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。 4、讨论：如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？ 　　答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。 （二）选择培养 1、目的： 　　增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。 2、制备选择培养基： 纤维素粉 5g NaNO3 1g Na2HPO4·7H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4·7H2O 0.5g KCl 0.5g 酵母膏 0.5g 水解酵素 0.5g 溶解后，蒸馏水定容至1000mL 　　a．该培养基是液体培养基还是固体培养基？为什么？ 　　答：是液体培养基，原因是配方中无凝固剂。 　　b．这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？ 　　答：有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。 　　c．你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用。 　　答：用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照。 3、操作方法： 　　称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊。吸取一定的培养液（约5mL），转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。 　　思考：为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 　　答：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。 （三）梯度稀释 　　按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数到106。 （四）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 1、制备鉴别培养基：参照旁栏中的比例 2、涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30℃倒置培养 （五）挑选产生透明圈的菌落 　　参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。将挑选的菌种接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在30℃－37℃培养，可获得纯培养。 　　两种刚果红染色法的比较： 　 方法一： 先培养微生物， 再加入刚果红进行颜色反应 方法二： 在倒平板时就加入刚果红 优点 显示出的颜色基本上是纤维素分解菌的作用 操作简便，不存在菌落的混杂问题 缺点 操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂 ①由于产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，所以可能产生假阳性反应。 ②有些微生物具有降解色素的能力，他们在培养过程中也会形成明显的透明圈，与纤维素的分解菌不易区分。 　　思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？ 　　答：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题先通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。 四、结果分析与评价 （一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 　　设置对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。 （二）分离的结果是否一 　　如果不同，分析产生不同结果的原因。 　　由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌