仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌的作用研究论文.docVIP

　　仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌的作用研究论文 .freelg·kg-1·d-1），荷瘤模型组；计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率；制备单细胞悬液，采用流式细胞仪检测各组小鼠LeL，中剂量组2.184g/mL，高剂量组4.368g/mL，分别相当于临床等效剂量的1、2、4倍。制备后于4℃冰箱中贮存备用。环磷酰胺（CTX）注射用粉针剂为山西普德药业有限公司产品（批号，200mg/支，临用前用生理盐水溶解，稀释浓度为2mg/mL，根据CTX的半数致死量（LD50）为472mg/kg，注射用量为LD50的1/3～1/5，故小鼠给药剂量设为20mg·kg-1·d-1。 1.4 主要试剂与仪器 碘化丙啶（PI）染液为晶美生物工程有限公司产品；bcl2兔多克隆抗体、即用型过氧化物酶免疫组织化学染色（SABC）试剂盒（SA1022）均为博士德生物工程有限公司产品；RPMI1640培养基为Gibco公司产品；二甲苯、乙醇，均为市售分析纯；超净工作台（苏净集团安泰公司）；冷冻桌面离心机（Eppendorf 5810R Centrifuge）；解剖显微镜（北京电子光学设备厂）；37℃电热恒温水浴箱（上海恒丰仪器仪表有限公司）；ALTRA型流式细胞仪（美国Beckman coulter公司）；CSⅣ型烤片机（孝感市电子仪器厂）；亿鸣200病理图像分析系统（中国亿鸣）。 1.5 LeL瘤细胞。消毒小鼠右前腋，取0.2mL（约1×106～2×106个瘤细胞）接种于皮下。传代3次。在无菌条件下剥离LeL（约1×106～2×106个瘤细胞）。 1.6 分组及给药 接种24h后随机分为5组:仙鱼汤高剂量组（剂量为1.747g/kg）、仙鱼汤中剂量组（剂量为0.874g/kg）、仙鱼汤低剂量组（剂量为0.437g/kg）、CTX阳性对照组（剂量为20mg/kg）、荷瘤模型组。中药各组均予以0.4mL中药灌胃，CTX组予以0.2mL腹腔注射，荷瘤模型组予以0.4mL生理盐水灌胃，均每日1次，给药14d。 1.7 观察指标及检测方法 1.7.1 小鼠生活状态观察 实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等情况。 1.7.2 抑瘤率 末次给药后24h，Le实验组/m模型组）×100%。 1.7.3 细胞周期分析及细胞凋亡检测 取小块瘤组织，加入生理盐水洗净血迹后倒掉，再加入1mL生理盐水，用眼科剪剪碎组织，吸管轻轻吹打，过300目筛，收集单细胞悬液于流式专用管，加入2mL中性磷酸盐缓冲溶液（PBS），1 300r/min离心5min洗涤2次，调整细胞计数约1×106/mL，加入体积分数70％冰乙醇2mL吹打后封口固定，保存于4℃冰箱24h。将固定的单细胞悬液离心，去固定液，加入PBS重新悬浮，洗涤2次，300目筛网过滤1次，加入1mL PI染液（终浓度100mg/L），4℃避光染色30min，流式细胞仪检测，收集50 000个细胞，应用multicycle软件分析凋亡率［5］。 1.7.4 病理检查 肿瘤组织经体积分数10％福尔马林固定24h后常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察肿瘤生长、肿瘤坏死、间质反应和肿瘤及肿瘤周围组织炎症细胞浸润情况并摄片。 1.7.5 bcl2阳性表达检测 采用免疫组化法。常规石蜡包埋后，4μm厚连续切片，行SABC法免疫组织化学染色，用PBS液代替一抗做阴性对照。光学显微镜下观察，bcl2蛋白染色细胞浆呈棕黄色为阳性。在高倍镜视野（400）下随机计数5个视野。计算出各组的染色强度指数（staining intensity index ，pSII）。pSII＝（pA强度瘤细胞×0）＋（pB强度瘤细胞×1）＋（pC强度瘤细胞×2）＋（pD强度瘤细胞×3）。其中A强度代表细胞浆无特异性染色；B强度代表细胞浆呈特异性浅棕黄色，染色较浅；C强度代表细胞浆呈特异性棕黄色；D强度代表细胞浆呈特异性深棕色，染色较深。染色强度指数（pSII）的范围在0～3 ［6］。 1.8 统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件处理。 2 结果 2.1 一般状况的观察 实验结束后，模型组、CTX组小鼠表现为身体瘦小，活动少，喜聚群，毛发缺少光泽；CTX组小鼠于实验5～7d开始出现脱毛，进食减少；仙鱼汤高、中、低剂量组小鼠脱毛现象少于CTX组及模型组，活动力优于CTX组及模型组。 2.2 各组抑瘤率比较 表1结果表明，仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组瘤体质量均低于模型组（Ｐ＜０.０５或Ｐ＜０.０１）。各仙鱼汤组随着药物剂量的增大，瘤体质量逐渐减轻，抑瘤率逐渐增高。 表1 各组Leor mass orinhibitory rate in different groups