传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建论文.docVIP

　　传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建论文 张萍，山丽梅，肖小河，付强 【关键词】 内皮,血管/细胞学；抑制消减杂交；动脉硬化 【Abstract】 AIM: To construct a subtracted cDNA library of differentially expressed genes in freshly isolated adult bovine aortic endothelial cells (FiBEC) and cultured neents of nonexpressed or loents plified library ly picked and identified using restriction enzyme digestion. RESULTS: The amplified library contained more than 760 bacterial clones. The 64 clones picked randomly shoe digestion. CONCLUSION: The library lays a foundation for screening and cloning the arteriosclerosisrelated genes in early stage. 【Key; vascular/cytology; suppression subtractive hybridization; arteriosclerosis 【摘要】 目的： 构建传代培养前后牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库，筛选动脉粥样硬化相关新基因构建文库. 方法： 采用抑制消减杂交技术，以新鲜分离和传代培养的牛主动脉内皮细胞作为对比材料，分离传代培养主动脉内皮细胞中不表达或低表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T/A连接构建文库.freelRNA提取试剂盒（美国Promega公司）；总RNA提取Trizol 试剂,DMEM培养基干粉,胎牛血清,SuperScriptTMRNaseH活性缺失反转录酶（美国Gibco BRL公司）；抑制削减杂交试剂盒（美国Clontech公司）；质粒提取试剂盒,PCR产物胶回收试剂盒（上海华舜公司）；IPTG, Xgal, TaqDNA聚合酶（上海生工公司）；保真LA Taq酶,DL2000核酸分子质量标准（大连TaKaRa公司）. 1.2方法 1.2.1牛主动脉内皮细胞总RNA及mRNA分离提取参照Trizol 试剂说明进行RNA提取；参照Z5300磁珠分离mRNA试剂盒操作说明进行mRNA分离提取. 1.2.2抑制消减杂交参照文献［4］及SSH试剂盒说明以FiBEC cDNA为检测子（Tester），以CnBEC cDNA为驱赶子（Driver）. ① 双连cDNA的合成：取Tester 和Driver mRNA 各2 μg（4 μL）分别与1 μL cDNA合成引物混合，在3.3×108 nkat/L AMV反转录酶1 μL作用下合成第一链cDNA. 立即在第一链合成反应液中加入20×第二链酶混合物、dNTP等，16℃反应30 min，合成双链cDNA. 抽提并沉淀cDNA，将沉淀物溶于50 μL灭菌水中. ② 双链cDNA的酶切：取Tester 和Driver双链cDNA各43.5 μL，分别用RsaⅠ 1.5 μL于37℃酶切1.5 h. 将未经酶切的ds cDNA 2.5 μL 与经酶切的ds cDNA 5 μL 用10 g/L琼脂糖明胶电泳进行酶切效率的分析. 酶切完全后，将酶切产物进行沉淀，沉淀物溶于5.5 μL灭菌水中. ③ Tester双链cDNA与接头的连接：将酶切后的Tester cDNA 按1∶6稀释，各取2 μL在T4DNA连接酶作用下，分别与接头1和接头2于16℃连结过夜. 取1 μL连接产物用200 μL灭菌水稀释，进行连接效率分析. 接头序列的adapter1 (5′CTAATACGA CTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT3′；3′GGCCCGTCCA5′) 及adapter 2 (5′CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT3′；3′ GCCGGCTCCA 5′). ④ 两轮消减杂交： 检测接头连接效率满意（25%）后，将连接有不同接头的Tester ds cDNA，于68℃杂交过夜. 加入200 μL稀释缓冲液. ⑤ 两轮抑制PCR： 取1 μL消减杂交产物用两个接头的外侧序列引物（5′ CTAATACGACTCACTATAGGGC 3′）进行首轮PCR扩增. 将PCR产物按1∶10 稀释