低分子肝素抗肝癌细胞增殖及机制研究论文.docVIP

　　低分子肝素抗肝癌细胞增殖及机制研究论文 陈公英 李敏伟 陈智 顾新宇 周慧明 【摘要】 ［目的］ 研究低分子肝素（LMMC-7721增殖作用及机制。［方法］ MTT法测LMMC-7721的生长抑制作用，流式细胞仪Annexin V FITC-PI法检测细胞凋亡发生率，同时ANN S.P.A大药厂）；MTT（Sigma公司） ； ANNEXIN V?鄄PI检测试剂盒（美国CALTAG 公司）；鼠抗人p53、bcl?鄄2 单克隆抗体（DAKO公司）； biotinylated protein ladder detection pack(cell signaling 公司)；肝癌细胞株SMMC?鄄7721购于中科院上海细胞生物所。主要仪器：免疫学标本制备仪（EPICS?鄄Q?鄄PREP型，美国Coulter公司产品），流式细胞仪（EPICS?鄄XL型，美国Coulter公司产品）。 1.2 方 法 1.2.1 细胞培养 肝癌细胞株SMMC?鄄7721采用含10%（V/V）的小牛血清、300μg/ml L?鄄谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和25μg/ml链霉素的RPIM1640（GIBCO BL）培养基、在37℃、5%CO2 及饱和湿度的条件下培养。 1.2.2 细胞增殖抑制试验 按文献方法1将对数生长期细胞按2×104（100μl）/孔接种于96孔板，用含10%的小牛血清的培养基100μl培养24h，去掉培养基，加入用完全培养基配制的不同浓度两种肝素（0～100U/ml），并选择合适剂量25U/ml、50U/ml肝素加入亚毒性剂量的阿霉素，用完全培养基加至100μl；同时设空白对照，每个浓度均设3个复孔。培养48h后，每孔加入20μl(5mg/ml)MTT，孵育4h。倾去上清液，加入二甲亚砜150μl/孔，于酶标仪上读取A570nm值，计算细胞生长抑制率=（1-实验组吸光值/对照组吸光值）×100%，得出量效关系曲线。 1.2.3 凋亡检测 将细胞以105/ml接种于24孔。用含有10%的小牛血清的培养基1ml培养24 h后倾去培养液，加入含合适剂量肝素的完全培养基1ml，培养48h,以不用肝素处理的细胞作阴性对照。采用流式细胞术检测Annexin V和碘化丙啶（PI）荧光标记细胞凋亡值。操作严格按试剂盒说明书进行。结果以Annexin V染色阳性，PI染色阴性判定。 1.2.4 SF，0.1g/L Leupeptin) (pH7.8) 4℃ 30min裂解细胞。15 000g 离心15min，取上清液。用Bradford法进行蛋白定量。加上样缓冲液(42mmol/L Tris?鄄HCl，10% 甘油, 2.3% SDS，5% 2?鄄巯基乙醇、0.002% 溴芬蓝) 煮沸3min后，10%SDS?鄄PAGE电泳、转移到PVDF膜，anti?鄄bcl?鄄2、p53一抗4℃孵育过夜，与标有HRP二抗结合，化学发光剂ECL显影。 1.3 统计分析 实验数据以平均值表示，采用SPSS10.0统计软件，进行独立样本t检验及直线相关分析。 2 结 果 2.1 肝素对肝癌细胞增殖的抑制作用 肝癌细胞SMMC?鄄7721在分别与不同剂量100U/ml、50U/ml、25U/ml、12.5U/ml的肝素培养48h进行后，其对细胞生长的抑制率分别为，肝素组17.8%、13.9%、13.7%、11.7%；低分子量肝素组31.7%、24.4%、16.6%、15.11%。相同浓度的两种肝素，LMMC?鄄7721细胞在与50U/ml浓度的肝素及亚毒性剂量的阿霉素（0.25μg/ml）共同培养48h后，进行MTT试验，其结果如图2所示。ADR（0.25μg/ml）抑制率10.2%、肝素14.4%、肝素+ADR 31.4%、LMMC?鄄7721细胞48h凋亡细胞明显增加。详见表1、图3。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylscrine，PS)分布于细胞膜内，细胞发生凋亡的早期便从膜内翻转至膜外。Annexin V在Ca＋＋存在时可以和PS特异结合。 2.4 肝素作用SMMC?鄄7721 p53，bcl?鄄2表达改变 在使用肝素处理SMMC?鄄7721细胞后，两种肝素两种剂量对p53基因表达无显著性影响，bcl?鄄2表达略降低，见图3。 3 讨 论 肿瘤患者往往伴发高凝血症及血管栓塞，有资料显示癌症合并静脉血栓患者，肝素的使用明显改善了患者的生存3。本文研究结果也进一步证明肝素抗肝癌细胞增殖的作用，故推测肝素可能有直接的抗癌作用。 以往的研究发现肝素的抗肿瘤作用涉及到抑制肿瘤形成、癌细胞生长及转移各个环节，在这些环节中肝素与其他物质相互作用，扮演着重要的角色4，5，如：①抗凝，②免疫调节，③抑制细胞黏附，④抑制肝素酶活性