催化Aldol加成反应的新型枯草芽孢杆菌BS168酰基氨肽酶的表达和应用.pdfVIP

V01．36 高等学校化学学报 No．12 UNIVERSITIES 2454—2460 2015年12月 CHEMICALJOURNALOFCHINESE 酰基氨肽酶的表达和应用 于潇潇，王 琦，周 烨，高仁钧，王英武 (吉林大学生命科学学院，分子酶学工程教育部重点实验室，长春130012) 摘要从枯草芽孢杆菌(Bacillus 酰基氨肽酶基因，并与典型的脯氨酸寡肽酶家族成员一致，含有2个独立的结构域，活性中心由催化三联体 表达菌中，在O．5mmol／L异丙基召一D．硫代半乳糖苷(IPTG)存在及20℃条件下诱导表达该蛋白．利用硫酸 铵沉淀与Ni亲和层析对BSU32230蛋白进行纯化，并通过实验证明该蛋白同时具有酯酶和肽酶2种活性．该 酶最佳反应温度为50℃，最佳pH值为8．0，40℃下半衰期约29h，在pH=4～10范围内稳定．该酶能够在 有机相中催化不对称Aldol加成反应，且反应产物的立体选择性较好(84．6％)． 关键词 酰基氨肽酶；枯草芽孢杆菌；Aldol反应 中图分类号0629．8 文献标志码A 酶作为绿色生物催化剂在医药、化工、食品和能源等领域的应用越来越广泛，特别是在一些底物 特异性反应、位置选择性反应和手性化合物的合成中发挥着不可替代的作用¨．2j．脯氨酸寡肽酶属于 丝氨酸蛋白酶家族，该家族成员按照序列相似性可分为许多种类，包括脯氨酸寡肽酶、二肽酰肽酶Ⅳ、 酰基氨肽酶、寡肽酶B和谷氨酰基释放酶等．脯氨酸寡肽酶家族主要成员问氨基酸序列的相似性较 低，但具有相似的三维结构，均由卢推进器结构域和邶水解酶结构域组成，催化三联体丝氨酸．天冬 纯化出来HJ，可催化N—od．酰基肽的N端水解反应释放出Ⅳ-Q一酰基氨基酸J，还可催化乙酰基、乙酰 氯、甲酸基及氨基甲烷等多肽的水解反应∞J，并得到1个酰基氨基酸和脱去1个氨基酸的肽(含1个 具有自由N端)．其水解二肽或三肽的速度远大于较长的肽一o，但不能水解N端酰化的蛋白旧J．目前， 已经有多种酰基氨肽酶从人红血球、牛肝、大鼠肌肉、牛晶状体和猪小肠黏膜中被提取分离∽一3|，其 中大部分序列信息已经获得．除了在动物体内发现酰基氨肽酶外，在植物和古细菌中也发现此类 酶‘14枷]． 非专业性催化在酶类中广泛存在，某些蛋白酶、脂肪酶和酯酶等能够在多种有机合成反应中发挥 作用¨7-201，此项研究的发展为进一步研究酶的结构与功能的关系以及开发酶的新功能等提供了新思 a质粒中，转入BLP(DE3)构建成工程菌，并对其最适表达条件及相关性质进行了研究． 人到pET-21 另外，选用对硝基苯甲醛与丙酮作为底物，利用BSU32230催化该反应(Scheme1)生成具有光学活性 H+叉 02N Scheme1 Aldolreaction BSU32230 catalyzedby 收稿日期：2015-05-04．网络出版日期：2015-10—10． 基金项目：国家自然科学基金(批准号和吉林省自然科学基金(批准号资助． 于潇潇等：催化Aldol加成反应的新型枯草芽孢杆茵BSl68酰基氨肽酶的表达和应用 为酶在有机合成领域中的应用提供了新思路． 1 实验部分 1．1试剂与仪器 Bacillussubtilis 168菌种由本实验室保藏；基因组提取试剂盒购自杭州维特洁公司；质粒pET-21a coli DNA聚合酶、超纯脱氧核糖核苷酸、 (+)和宿主菌EscherichiaBLP(DE3)购自Novagen公司；Taq DNA聚合酶及T4DNA连接酶等购自TakaraBiotech公司；质粒小提试剂盒和琼脂 限制性内切酶、pfu 酰．谷氨酸(Asp．Ala)