水稻转基因实验方法与步骤.docVIP

水稻转基因 一、实验目的 二、实验原理 NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟； 4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。 诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中； 2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天； 3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。 以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织 消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒： 将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒2分钟； 2）倒去酒精，加入100ml 20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗； 操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周； 在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周） 农杆菌培养 挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100μl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。 共培养和抗性愈伤组织的选择 1．感菌与共培养： 取培养好的菌液500μl于1.5ml离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01； 将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟； 将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟； 将愈伤组织置于共培养基上。25℃暗培养2.5天。 选择： 将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）的无菌水清洗1~2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2小时； 将晾干的愈伤转入含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）和50mg/l潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，光照培养14天； 将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）和50mg/l潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。 抗性愈伤组织的预分化（可选） 将新长出的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，25℃，光照培养7天。 抗性愈伤组织的诱导分化和生根 挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中（每皿或每瓶放置5-7颗），用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗（15-30天）。待苗长至1cm左右，放入生根培养基中壮苗 注： 以上一至五的操作步骤皆在无菌条件下进行。 转基因苗的锻炼和移栽 转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月左右。将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。 四、注意事项