犬副流感病毒的检测和NP基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫学活性的研究.pdfVIP

犬副流感病毒的检测和NP 基因的克隆、表达及其重组蛋白的免 疫学活性的研究 摘要 犬传染性呼吸系统疾病（Canine Infectious Respiratory Disease，CIRD ）即犬窝咳，临床特征表 现为发热、咳嗽、流涕，是一种多因素和多病原引起的犬的重要疾病，其中犬副流感病毒（Canine Parainfluenza Virus ，CPIV ）是CIRD 的主要病原。犬副流感病毒属副黏病毒，是不分节段的RNA 病 毒，其基因全长为15246nt，主要由NP 基因、P 基因、M 基因、F 基因、HN 基因、L 基因组成。1967 年Binn 等人首次用犬肾细胞（MDCK ）从具有呼吸道症状的病犬中分离得到CPIV 。血清学调查表 明CPIV 在世界各国普遍存在，是危害犬业重要传染病之一。 本研究工作主要分三个部分来进行： 1．本研究首先通过建立犬副流感病毒RT-PCR 检测方法，用于检测 CPIV 。经特异性试验、敏 感性试验和重复性试验表明建立的RT-PCR 方法是一种比较良好的检测CPIV 的方法。采用此方法对 临床收集的32 份样品进行检测，阳性率为53.12 ％。 2 ．克隆的犬副流感病毒NP 基因全长为 1658bp。首先从病犬的鼻腔分泌液中提取总RNA ，然 后用RT-PCR 扩增得到目的基因，将其克隆到PMD18-T simple vector 中，测序检验。结果表明获取 的NP 基因核苷酸序列与GeneBank 中标准序列存在三处碱基变异，导致编码的蛋白质出现三个氨基 酸的变异。 3 ．用PCR 技术以NP 蛋白全基因质粒为模板扩增出NP 蛋白的表达基因序列 1530bp，然后将 其定向插入到PGEX-6P-1 中，构建其原核表达载体PGEX-6P-1-NP ，并且在大肠杆菌BL21 （DE3 ） 中成功表达，经Wester-blot 分析结果表明重组融合蛋白（GST -NP ）蛋白具有一定的免疫学活性。 关键词：犬副流感病毒；RT-PCR ；克隆；NP 蛋白；原核表达；免疫学活性 I Detection of Canine Parainfluenza Virus and Study on Cloning and Expression of CPIV-NP Gene and Immunocompetence of Its Recombinant Protein Abstract Canine infectious respiratory disease(CIRD)in dogs,referred to respiratory illness kennel cough.The main clinical symptoms of including fever,cough and nose running,which were caused by such as multiplex,pathogens,virus and bacterium,and canine parainluenza virus(CPIV) was main cause of CIRD.CPIV was a single-strand negative RNA virus which belongs to the paramyxoviridae family.The total genome of CPIV is approximately 15245nt,which contain NP, P, M, F, HN and L genes.Binn and his colleges first isolated a strain of CPIV from