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全人源单抗-修美乐;Contents:;一、研发背景;一、研发背景;一、研发背景;全人源抗体制备的四种途径: 一.从采集的病人血样中构建 Fab或者ScFv文库，并通过噬菌体展示筛选抗体库，来产生人源MAb。 二.用含有人免疫球蛋白基因位点的转基因小鼠进行免疫，可以产生人抗体的免疫应答，这样通过传统的杂交瘤技术可以来生产人源MAb。;全人源抗体制备的四种途径: 三.通过分离培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，然后用抗原进行免疫刺激，产生免疫应答，然后再和人类骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，经筛选得到人源单克隆抗体，并立即进行分子克隆抗体基因，必要时通过亲和力成熟技术提高其与药靶抗原的亲和力，再克隆进入可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体，这种抗体完全是在人细胞环境中生成的。 四.通过分离和低密度(约500B细胞每96孔)培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，对培养上清进行抗原特异性筛选，对阳性孔B细胞进行分子克隆获得人抗体基因，再使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体。 ;阿达木单抗是重组人源IgG1单克隆抗体，阿达木单抗含有人源轻链和重链可变区序列和人源IgG1，κ链恒定区序列，包括1330氨基酸残基，分子量大概有148kD。 该抗体对hTNF-α具有很高的亲和性（Kd=10-8M or less）和比较低的解离速率（Koff=10-3/s or less)，阻止其与细胞表面的TNF受体 p55，p75 位点结合，能够使体内表面TNF 表达的细胞裂解，导致TNF 水平降低。能够中和hTNF-α的活性包括hTNF-α诱导的细胞毒性和细胞活化作用。 关于D2E7的结合特异性，其可与各种形式的hTNFα结合，包括可溶性hTNFα，跨膜hTNFα和与细胞受体连接的hTNFα。D2E7不会与其它细胞因子特异性结合。 ;轻链可变区序列;重链可变区序列;重组人源抗体的筛选 1.建立人源scFV噬菌体抗体库。其是从人类淋巴细胞中分离的编码重链和轻链可变区的mRNA经噬菌体展示技术得到的。 2.为了分离与hTNFα具有高亲和力和低解离率的人源抗体，选择对hTNFα具有高亲和力的鼠源抗体（MAK 195）用抗原表位印记（epitope imprinting)的方法选择对hTNFα具有亲和力的人源序列。 3.选好了VH和VL片段之??，“mix and match”实验用来筛选合适的VH和VL配对。 4.获得编码合适抗体的DNA序列后，亚克隆于其它表达载体进行表达。 ;;这可通过PCR对人源轻链和重链的修饰和扩增获得。 例如为了获得D2E7或与其相近抗体的编码重链可变区的DNA片段，人VH基因的VH3基因家族中某一基因（DP-31)通过PCR进行扩增。为了获得轻链可变区基因片段，人VL基因的VκI家族中的某一基因（A20）通过PCR进行扩增。;例如把可变区序列转变为完整的抗体，Fab或者scFV片段。即把轻重链可变区序列分别与其对应的恒定区结合，重链恒定区可以是IgG1-4、IgA、IgD、IgM和IgE，最好是IgG1和IgG4的恒定区。轻链恒定区可以是κ和λ链恒定区，最好是κ链恒定区。 ;为了表达D2E7，抗体的轻链基因和重链基因可以插入到不同的载体，但最好插入到同一载体。 D2E7或者其相关的轻链和重链基因在连接到载体之前，载体上可能已经携带抗体恒定区序列。 另外，重组表达载体可以编码一个信号肽，从而有利于抗体从宿主细胞的分泌。 除了抗体链基因，重组表达载体携带了可调控抗体链基因在宿主细胞表达的调控序列。调控序列包括启动子，增强子和其它表达控制元件。 除了抗体链基因和调控序列，该重组表达载体还可以携带其他序列，如调控载体复制的序列和选择标记基因。;把携带有抗体轻链和重链基因的载体转染到宿主细胞中去： 尽管在理论上其在真核和原核细胞中都能表达，在真核细胞尤其是哺乳动物细胞中表达是最好的方式。 表达重组抗体的细胞倾向于使用CHO细胞（包括dhfr-CHO细胞，含有DHFR选择性标记），NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。 重组表达载体转入宿主细胞后经过一段时间的表达，表达后的抗体分泌到培养基上。然后利用蛋白质纯化的方法收集抗体。 宿主细胞也可以用来产生不完整的抗体，如Fab或者scFV分子。研发过程试验了各种形式的抗体，重组DNA技术可以用来排除不能结合hTNFα的抗体。;对于抗体或者其抗原结合部位的表达最倾向于使用载有编码抗体重链和轻链的基因的重组表达载体通过磷酸钙转染法转入到dfhr-CHO细胞中。 重组表达载体中，轻链和重链基因连接到CMV增强子和AdMLP（腺病毒）启动子以增强其高水平表达。 重组表达载体携带有DHFR标记基因，可用甲氨蝶呤进行选择。最后培养宿主细胞进行抗体的表达，并从培养基