骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中作用的研究-培训课件.pptxVIP

骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中 作用的研究 作者：## ########### 前言 材料和方法 结论 结果 一 前言 二 材料与方法 三 结果 四 结论 又称为Spp1(分泌型磷酸糖蛋白1)或ETA-1(早期T淋巴细胞活化因子)，是一种多功能的胞外基质蛋白，表达于多种组织和细胞中； 有两种形式：分泌型骨桥蛋白( sOPN)和胞内型骨桥蛋白 (iOPN)； 早期研究发现，OPN能够抑制炎症反应的发生，但在不同的环境中OPN的作用可能会表现出不同的侧重。 骨桥蛋白(OPN) 研究背景 累及全消化道的一种特发性肠道炎症性疾病； 病因和发病机制尚未完全明确，已知肠道黏膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD发病中起重要作用； 研究发现，OPN在炎症性肠病患者发炎的肠道组织中的表达增加。 炎症性肠病（IBD） ＯＰＮ对ＩＢＤ患者会产生何种影响？ 问题 一 前言 二 材料与方法 三 结果 四 结论 研究目的 （1）采用 IBD 小鼠模型实验观察 OPN 缺失对小鼠自发性结肠炎的影响 （2）研究骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中的作用 二 材料与方法 一 前言 三 结果 四 结论 研究对象 临床症状 临床评分标准 体重下降超过5% 脱肛 腹泻 二 材料与方法 一 前言 三 结果 四 结论 对IL-10 KO 和 OPN/IL-10 DKO 小鼠的临床症状表现进行评分。出现该临床症状计1分，否则为0。合计得出总分。 肛周粘液分泌物 二 材料与方法 一 前言 三 结果 四 结论 实验方法与步骤 患结肠炎小鼠结肠组织切片微观分析 基因表达定量分析 荧光原位杂交技术（FISH）检测分泌的磷蛋白1基因编码区OPN 酶联免疫吸附法量化上清液中TNF-α、IL-6、IL-12p40含量 小鼠肠粘膜固有层单个核细胞的分离 末端限制性片段长度多态性分析 提取小鼠腹腔巨噬细胞分析吞噬作用 肠系膜淋巴结细菌种类的鉴别 统计分析(非参数Mann-Whitney U 检验或Bonferroni校正单向分析) 8 7 6 5 4 3 2 1 9 10 小鼠骨髓衍生的巨噬细胞的 准备和刺激 二 材料与方法 一 前言 三 结果 四 结论 实验方法与步骤 1.提取mRNA（异硫氰酸胍-酚氯仿法）； 2.进行反转录（SuperScript II反转录酶）； 3.分析互补DNA对GAPDH，IL-6，IFN-γ，IL-17A和CD11bmRNA的表达（LightCycler 480 System II）； 4.目的基因以GAPDH为参照标准。 基因表达定量分析 GAPDH 5’-CAA CTTTGT CAA GCT CAT TTC C-3’(正) 5’-GGT CCA GGG TTT CTT ACT CC-3’ (反) IL-6 5’-AGT CCG GAG AGG AGA CTT CA-3’ (正) 5’-ATT TCC ACG ATT TCC CAGAG-3’ (反) IFN-γ 5’-AGC TCT TCC TCA TGG CTG TT-3’ (正) 5’-ATC TGGCTC TGC AGG ATT TT-3’ (反) IL-17A 5’-TCT CTG ATG CTG TTG CTG CT-3’ (正) 5’-CGT GGA ACG GTT GAG GTA GT-3’ (反) CD11b 5’-GCT CCG GTA GCATCA ACA AC-3’ (正) 5’-AGT GAA TCC GGA ACT CGT CCG-3’ (反) 引物序列 二 材料与方法 一 前言 三 结果 四 结论 实验方法与步骤 1.小鼠股骨和胫骨骨髓中提取骨髓细胞； 2.含10%热灭活的胎牛血清，100mg/ml链霉素，100mg/ml 青霉素和40ng/ml重组巨噬细胞集落刺激因子RPMI1640培养液中37°C培养5天； 3.衍生的巨噬细胞按5×105个细胞/孔接种于6孔培养板，经10ng/ml IFN-γ隔夜孵化后，用以下刺激物（Pam3CSK4 50 -500 ng/ml、LPS 100 ng/ml、ODN1